黃連素對人胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡影響的研究

李舒 楊從意 魯艷平 徐靖雯 胡敬寶

摘要?目的：探討黃連素對人胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡的影響。方法：MTS法檢測不同濃度的黃連素（100、150、200?μmol/L）對胃癌細(xì)胞的抑制作用，Hoechst?33258染色檢測不同濃度的黃連素（100、150、200?μmol/L）對細(xì)胞凋亡的影響;Real?Time?Q-PCR檢測胃癌細(xì)胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表達(dá);Western?blot檢測胃癌細(xì)胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)。結(jié)果：不同濃度的黃連素能顯著降低人胃癌細(xì)胞SGC701活性（P<0.05，P<0.01），促進(jìn)其凋亡，升高Cleaved?Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表達(dá)水平（P<0.05，P<0.01），降低Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論：不同濃度的黃連素可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與升高Cleaved?Caspase-3、Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞?黃連素;SGC7901細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax;抗腫瘤;機(jī)制研究

Effects?of?Berberine?on?Apoptosis?of?Gastric?Cancer?Cell?Line?SGC7901

LI?Shu1，YANG?Congyi1，LU?Yanping1，XU?Jingwen2，HU?Jingbao1

（1?Bao′an?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，Shenzhen?518101，China;?2?Guangzhou?University?of?Chinese?Medicine，Guangzhou?510405，China）

Abstract?Objective：Current?studies?showed?that?berberine?had?a?certain?anti-tumor?effect，but?its?antitumor?mechanism?did?not?have?depth?study?yet.This?study?discussed?that?the?influence?of?berberine?on?human?gastric?cancer?cells?SGC7901′s?apoptosis.Methods：The?inhibition?of?gastric?cancer?cells?induced?by?different?concentrations?of?berberine（150?μM，200?μM，250?μM）was?determined?by?MTS.Hoechst?33258?staining?method?detected?the?apoptosis?of?gastric?cancer?cells?induced?by?different?concentrations?of?berberine（100?μmol/L，150?μmol/L，200?μmol/L）.The?mRNA?and?protein?expressions?of?Cleaved?Caspase-3，Bcl-2，and?Bax?of?gastric?cancer?cells?were?assessed?by?Real?Time?Q-PCR?and?western?blot.Results：Different?concentrations?of?berberine?could?significantly?reduce?the?human?gastric?cancer?cells?SGC701′s?activity，promote?its?apoptosis，increase?mRNA?and?protein?expressions?of?Cleaved?Caspase-3，Bax，and?reduce?the?mRNA?and?protein?expressions?of?Bcl-2.Conclusion：Different?concentrations?of?berberine?could?reduce?gastric?cancer?cells?apoptosis.The?mechanism?might?be?elevated?the?expressions?of?Cleaved?Caspase-3，Bax?and?reduced?the?expression?of?bcl-2.

Keywords?Berberine;?SGC7901;?Cell?apoptosis;?Cleaved?Caspase-3;?Bcl-2;?Bax;?Anti-tumor;?Mechanism?research

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.01.011

黃連素（Berberine）是中藥黃連的主要提取物，研究證實具有廣泛的生物學(xué)作用。近年來大量的實驗證實黃連素具有抗腫瘤的作用[1]，對肺癌、食管癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用。Ahmadiankia等[2]發(fā)現(xiàn)，10、20、40、80?μmol/L的黃連素可降低乳腺癌細(xì)胞MCF-7的遷移能力，并可下調(diào)某些趨化因子受體的mRNA表達(dá)水平。研究[3]發(fā)現(xiàn)，黃連素可通過抑制N乙酰轉(zhuǎn)移酶活性而抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖。Yip?NK[4]發(fā)現(xiàn)黃連素可通過升高Bax基因的表達(dá)降低肝癌細(xì)胞的活性，但其對胃癌細(xì)胞是否有抑制作用還有待進(jìn)一步研究。本研究擬以人胃癌細(xì)胞SGC7901為靶細(xì)胞，觀察不同濃度的黃連素對其凋亡發(fā)揮的作用，為臨床運(yùn)用提供一些參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細(xì)胞?人胃癌細(xì)胞株SGC7901由廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)內(nèi)科實驗室贈予。

1.1.2?試劑和儀器?黃連素（純度≥98%）購自美國sigma公司，批號LRAA9232。1640培養(yǎng)基購自美國Gibico公司，批號LRAA9232;胎牛血清購自美國Biological?Indμstries公司，批號1608796;青霉素、鏈霉素購自美國Gibico公司，批號1829771;胰酶購自美國Gibico公司，批號1846496。Cleaved?Caspase?3一抗購自Cell?Signaling?Technology公司，批號21;Bcl-2一抗購自R&D?System公司，批號CDVT0116122;Bax一抗購自ABclonal公司，批號9002211001;所有二抗均購自美國ABclonal公司;PCR試劑盒購自瑞士Roche公司，批號16241700。

1.2?方法

1.2.1?細(xì)胞培養(yǎng)?人胃癌細(xì)胞SGC7901常規(guī)置于1640完全培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清，1%青霉素、鏈霉素，在37?℃，體積分?jǐn)?shù)為5%?CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2?MTS篩選黃連素干預(yù)SGC7901的最佳濃度取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞，制成2×103/mL的單細(xì)胞懸液，100?μL/孔接種于96孔板中，邊緣用PBS填充，細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液，對照組加入1640培養(yǎng)基100?μL，實驗組分別添加含不同濃度黃連素（100、150、200?μmol/L）的培養(yǎng)液100?μL，每組接種10個副孔，分別培養(yǎng)24、48、72?h后，每孔加入MTS/PMS混合液20?μL，繼續(xù)避光孵育4?h后用酶標(biāo)儀檢測490?nm波長的吸光度。

1.2.3?Hoechst?33258染色檢測細(xì)胞凋亡情況?取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長至80%滿時吸棄培養(yǎng)液，對照組加入1640培養(yǎng)基2?mL，實驗組分別添加含不同濃度黃連素（100、150、200?μmol/L）的培養(yǎng)液2?mL繼續(xù)培養(yǎng)24?h。吸去培養(yǎng)液后加入固定液，固定5?min，PBS清洗2遍后加入Hoechst?33258染色液，染色5?min，PBS再次清洗2遍后滴一滴抗熒光淬滅液，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)呈濃染致密熒光，而正常細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)呈均勻的熒光。

1.2.4?Real?Time?Q-PCR檢測胃癌細(xì)胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)?取生長良好的MSC，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL接種于60?mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長至80%時換液，實驗組分別加入含100、150、200?μmol/L黃連素的培養(yǎng)液，對照組只加1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24?h后，用PBS洗細(xì)胞3次，采用Trizol法提取總RNA。PCR反應(yīng)體系：cDNA?5?μL、上游引物（10?μmol/L）0.5?μL、下游引物（10?μmol/L）0.5?μL、2x?SYBR?Green?PCR?Master?Mix?10?μL、dH2O?4?μL，反應(yīng)條件：95?℃?5?min，95?℃?15?s，60?℃?32?s讀板，循環(huán)40次，反應(yīng)完成后，計算機(jī)自動分析熒光信號，并將其轉(zhuǎn)換為Ct值，根據(jù)2-△△Ct計算Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.2.5?Western?blot檢測胃癌細(xì)胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)?取對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞，接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長至80%時換液，實驗組分別加入含100、150、200?μmol/L黃連素的培養(yǎng)液，對照組只加1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24?h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)，封閉后4?℃孵育一抗過夜，TBST洗膜后加入相應(yīng)二抗稀釋液37?℃孵育1?h后顯影。并用Image?J軟件分析灰度值。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法?采用SPSS?23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用One-Way?ANOVA檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?黃連素對胃癌細(xì)胞存活率的影響?不同濃度的黃連素（100、150、200?μmol/L）干預(yù)24～72?h后，均對胃癌細(xì)胞存活有一定的抑制作用，且伴隨作用濃度及作用時間的增加，胃癌細(xì)胞的存活率越低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），表明黃連素對降低胃癌細(xì)胞存活率有一定的濃度與時間依賴性。見圖1。

2.2?黃連素對胃癌細(xì)胞形態(tài)的影響?不同濃度的黃連素（100、150、200?μmol/L）干預(yù)24?h后，對照組細(xì)胞的細(xì)胞核邊緣光滑整齊，呈均勻的淡藍(lán)染色，黃連素組細(xì)胞的細(xì)胞核邊緣不整齊，核固縮，呈致密濃染，并伴隨黃連素的濃度增高，細(xì)胞核的改變更明顯。見圖2。

2.3?黃連素對胃癌細(xì)胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)mRNA的影響?與對照組比較，隨著黃連素給藥濃度的增加，胃癌細(xì)胞中Cleaved?Caspase-3、Bax的mRNA表達(dá)水平逐漸升高，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平逐漸降低，呈明顯的濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見圖3。

2.4?黃連素對胃癌細(xì)胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響?與對照組比較，隨著黃連素給藥濃度的增加，胃癌細(xì)胞中Cleaved?Caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)水平逐漸升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平逐漸降低，呈明顯的濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見圖4。

3?討論

胃癌是起源于胃上皮的惡性腫瘤，是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在全世界有很高的發(fā)生率和死亡率[5-6]。研究表明，黃連素的抗腫瘤功能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡實現(xiàn)的[7]，而細(xì)胞的凋亡又與Bcl-2家族和Caspase家族密切相關(guān)。

細(xì)胞凋亡是各種內(nèi)外因素作用下細(xì)胞發(fā)生的程序性死亡過程，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制，其與癌癥等諸多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療癌癥的重要途徑之一[8]。Caspase家族可通過線粒體通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，而Caspase-3是Caspase家族重要的凋亡執(zhí)行者，屬于凋亡執(zhí)行因子，位于級聯(lián)反應(yīng)的下游[9]，活化后的Caspase-3是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[10]。Cleaved?Caspase-3是Caspase-3活化過程中產(chǎn)生的活性片段，其表達(dá)水平可反應(yīng)Caspase-3活性程度及細(xì)胞凋亡水平[11]。Bcl-2家族是線粒體通路的重要環(huán)節(jié)，可調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性，從而釋放細(xì)胞色素C，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。Bax位于細(xì)胞質(zhì)，其可在凋亡程序啟動后助細(xì)胞色素C釋放，從而激活其下游的Caspase家族，促進(jìn)凋亡[13]。Bcl-2位于線粒體膜，其作用是穩(wěn)定線粒體膜，阻止釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而抑制凋亡[14-15]。

為了探討黃連素抑制人胃癌細(xì)胞SGC7901的作用機(jī)制，本實驗首先通過MTS法觀察不同濃度黃連素對胃癌細(xì)胞活性的抑制作用，隨后通過Hoechst?33258染色法觀察其對細(xì)胞形態(tài)的影響，再通過Real?Time?Q-PCR和Western?Blot檢測不同濃度的黃連素對胃癌細(xì)胞基本和蛋白的表達(dá)水平。本實驗結(jié)果表明，超過100?μM的黃連素可以顯著降低人胃癌細(xì)胞SGC7901的活性，且有明顯的濃度與時間依賴性;黃連素還可以顯著上調(diào)Cleaved?Caspase-3和Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，且隨著其濃度的升高，表達(dá)差異越顯著。表明黃連素誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡可能是通過活化Bax和Bcl-2，激活Caspase-3通過線粒體途徑實現(xiàn)的。

綜上所述，黃連素對人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖有較好的抑制作用，可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)其凋亡，為中醫(yī)藥在臨床的運(yùn)用提供了新的方向。

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（2018-12-04收稿?責(zé)任編輯：芮莉莉）

基金項目：廣東省青年創(chuàng)新人才類項目自然科學(xué)類基金（2016KQNCX018）;高水平大學(xué)建設(shè)項目（A1-AFD018171Z11087）作者簡介：李舒（1990.05—），女，博士，醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治消化系統(tǒng)疾病，E-mail：suelee525@126.com通信作者：胡敬寶（1965.07—），男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療消化道疾病，E-mail：rzzyhjb@126.com