氫溴酸沃替西汀有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法

杜娟花，黃美容，曹陽(yáng)，黃順旺，曹明成

作者單位：合肥創(chuàng)新醫(yī)藥技術(shù)有限公司，安徽 合肥230088

氫溴酸沃替西?。╒orticetineHydrobromide），也稱氫溴酸伏硫西汀，CAS：508233-74-7，化學(xué)名為1-[2-（2，4-甲基苯硫基）苯基]哌嗪氫溴酸鹽，被認(rèn)為是一種新型多模型抗抑郁藥物[1]，是由日本武田制藥和丹麥靈北公司共同開(kāi)發(fā)用于治療重度抑郁癥成人病人的藥物，體外研究表明，其具有可拮抗5-HT3、5-HT7及5-HT1D受體，激活5-HT1A受體，部分激活5-HT1B受體及抑制5-HT的轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[2]。是第一個(gè)具備多種藥效活性的抗抑郁藥物，該藥物尚無(wú)國(guó)產(chǎn)化。

我們從2013年4月開(kāi)始研究氫溴酸沃替西汀。該藥物的合成由2，4-二甲基苯硫酚與鄰碘溴苯反應(yīng)合成2-（2，4-二甲基苯基硫基）硫醚，再與哌嗪反應(yīng)制備沃替西汀，之后成氫溴酸鹽，得到終產(chǎn)品[3-8]。制備過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)并經(jīng)結(jié)構(gòu)確證有雜質(zhì)A～K。見(jiàn)圖1。

本研究測(cè)定氫溴酸沃替西汀的有關(guān)物質(zhì)為外標(biāo)法、主成分自身對(duì)照法，靈敏度好、準(zhǔn)確度高，可作為原料質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)方法。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀（島津公司，日本）；AG135電子分析天平（梅特勒托利多公司，瑞士）。

圖1 氫溴酸沃替西汀制備過(guò)程中的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)圖

氫溴酸沃替西汀對(duì)照品（批號(hào)：20131201-J，含量：99.6%）、雜質(zhì)A（批號(hào)20131101，純度97.2%）、雜質(zhì)B（批號(hào) 20131102，純度 99.4%）、雜質(zhì)C（批號(hào)20131103，純度97.3%）、雜質(zhì)D（批號(hào)20131104，純度99.6%）、雜質(zhì)E（批號(hào)20131106，純度99.2%）、雜質(zhì)F（批號(hào)13-08-0137，純度99.2%）、雜質(zhì)G（批號(hào)20131107，純度95.0%）、雜質(zhì)H（批號(hào)20131105，純度98.8%）、雜質(zhì)I（批號(hào)20131108，純度98.5%）、雜質(zhì)J（批號(hào)20131109，純度93.3%）、雜質(zhì)M（批號(hào)13-08-0138，純度95.1%）；氫溴酸沃替西汀原料藥（批號(hào)20150901～20150903、20160301～20160303），以上對(duì)照品中雜質(zhì)F、M為SINCO PHARMACHEM提供，其余對(duì)照品及供試品均為合肥創(chuàng)新醫(yī)藥技術(shù)有限公司合成。乙腈、三乙胺為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備 對(duì)照品貯備液1：取雜質(zhì)B、D、E、F、G、H、I、J、M對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并稀釋，制備成每1 mL含9個(gè)雜質(zhì)各25 μg的混合溶液。

對(duì)照品貯備液2：取雜質(zhì)B、D、E、F、G、H、I、J、M對(duì)照品與氫溴酸沃替西汀對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并稀釋，制備成每1 mL含氫溴酸沃替西汀與9個(gè)雜質(zhì)各25 μg的混合溶液。

雜質(zhì)對(duì)照品溶液：精密量取1 mL雜質(zhì)對(duì)照品貯備液1，置50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：精密稱取氫溴酸沃替西汀原料25 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

0.1 %對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度并搖勻；精密量取該稀釋液1 mL，置20 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度并搖勻，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：精密量取1 mL對(duì)照品貯備液1，置50mL量瓶中，加入經(jīng)精密稱定的25 mg氫溴酸沃替西汀原料，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)226 nm；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相A：0.5%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.0）-乙腈（90∶10），流動(dòng)相B：0.5%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0）-乙腈（10∶90），梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

稱取雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、H、J、M、I適量，制備各雜質(zhì)的單標(biāo)溶液，進(jìn)行定位，再進(jìn)注系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)行液相色譜分析。見(jiàn)圖2。

系統(tǒng)適用性溶液中各已知雜質(zhì)均能與主成分達(dá)到較好分離，分離度均良好。

2.3 專屬性 取氫溴酸沃替西汀原料25 mg，置50 mL量瓶中，分別進(jìn)行高溫、光照、氧化、酸、堿破壞，酸、堿破壞進(jìn)行中和，再用乙腈溶解并稀釋定容，搖勻；并同法制備破壞空白。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，本品在強(qiáng)光及高溫條件下有少量降解雜質(zhì)，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化時(shí)能產(chǎn)生明顯降解雜質(zhì)。且主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度能符合要求，破壞前后物料基本守恒，主峰純度符合要求。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖

2.4 定量限、檢測(cè)限、線性范圍與校正因子 精密量取對(duì)照品貯備液2，加乙腈稀釋成0.2～2.0 μg/mL不同濃度的系列對(duì)照品混合溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以各成分的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，并以回歸方程的斜率計(jì)算各已知雜質(zhì)相對(duì)于氫溴酸沃替西汀的校正因子（RCF），同時(shí)測(cè)定各成分的定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 氫溴酸沃替西汀有關(guān)物質(zhì)線性和RCF

2.5 精密度與準(zhǔn)確度 精密度：按“2.1”項(xiàng)下方法由雙人各制備供試品6份，在“2.2”色譜條件下，以不同液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各雜質(zhì)RSD。單人、6份樣品，總雜含量的RSD均＜7.5%，單個(gè)雜質(zhì)含量的RSD均＜10%。雙人共12份樣品，總雜含量的RSD均＜10%，單個(gè)雜質(zhì)含量RSD均＜15%。

精密量取雜質(zhì)對(duì)照品貯備液1，加入供試品中，制成含各已知雜質(zhì)為限度的50%、100%、150%的回收率樣品，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算各雜質(zhì)回收率。9個(gè)已知雜質(zhì)B、D、E、F、G、H、I、J、M的平均加樣回收率在（100.2±1.1）%。

2.6 溶液穩(wěn)定性 按“2.1”項(xiàng)下制備雜質(zhì)對(duì)照品溶液與供試品溶液，25 ℃放置，并于0、2、4、8、12、24 h分別取樣進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。計(jì)算得雜質(zhì)對(duì)照品溶液中單個(gè)雜質(zhì)峰面積的RSD均＜4%，供試品溶液中，各雜質(zhì)峰面積的RSD均＜15%，且無(wú)新雜質(zhì)產(chǎn)生。

2.7 耐用性 通過(guò)分別調(diào)整色譜條件中的柱溫±2℃、檢測(cè)波長(zhǎng)±2 nm及pH值±0.2，考察系統(tǒng)適用性溶液中雜質(zhì)與主成分之間分離度的情況。結(jié)果表明，柱溫、流速及pH值等參數(shù)的調(diào)整對(duì)測(cè)定結(jié)果基本不會(huì)產(chǎn)生影響，方法的耐用性良好。

2.8 樣品測(cè)定 按上述已確定的色譜條件及方法，對(duì)氫溴酸沃替西汀原料6批進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中已知雜質(zhì)含量，自身對(duì)照法計(jì)算未知雜質(zhì)含量。其中，雜質(zhì)B～I(xiàn)均未檢出。其他雜質(zhì)檢測(cè)見(jiàn)表3。

表3 氫溴酸沃替西汀有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果/%

3 討論

以乙腈為溶劑，分別配制氫溴酸沃替西汀和9個(gè)已知雜質(zhì)（雜質(zhì)B、D、E、F、G、H、I、J、M）的對(duì)照品溶液，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，氫溴酸沃替西汀和雜質(zhì)B、G、J）在226 nm處有最大吸收，雜質(zhì)D、E、F、H、I、M在226 nm處均有較大吸收，故采用226 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。根據(jù)專利[9]中有關(guān)物質(zhì)，流動(dòng)相為甲醇：乙酸銨緩沖液的反相體系；為了改善各雜質(zhì)的峰形，將流動(dòng)相中緩沖系統(tǒng)定為磷酸-三乙胺緩沖體系，進(jìn)行優(yōu)化后確定梯度洗脫程序，各組分的峰形良好，分離度符合要求，故選擇該流動(dòng)相體系。

國(guó)外藥典尚未收載氫溴酸沃替西汀原料或制劑標(biāo)準(zhǔn)，在已有文獻(xiàn)[10-14]報(bào)道的有關(guān)物質(zhì)研究中，有HPLC法、液質(zhì)聯(lián)用法、ESI-Q-TOF/MS、APCI-TOF/MS等方法，檢測(cè)的雜質(zhì)數(shù)量2～7個(gè)，涉及的雜質(zhì)含本研究中的雜質(zhì)B、E、F、I、M。本研究中由于雜質(zhì)A與雜質(zhì)C分別是由起始原料2，4-二甲基苯硫酚中的2，5-二甲基苯硫酚與3，4-二甲基苯硫酚參與化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物，且單標(biāo)定位時(shí)雜質(zhì)A、C與主峰的出峰位置相同，故可通過(guò)控制起始原料2，4-二甲基苯硫酚的產(chǎn)品質(zhì)量來(lái)控制成品中雜質(zhì)A、雜質(zhì)C的含量；雜質(zhì)G、J為鄰溴碘苯中雜質(zhì)間溴碘苯、對(duì)溴碘苯分別參與反應(yīng)生成的，與氫溴酸沃替西汀為苯環(huán)上位置異構(gòu)雜質(zhì)，分離難度較大；雜質(zhì)D、H為鄰溴碘苯與哌嗪進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生的雜質(zhì)。本研究在液相色譜條件下氫溴酸沃替西汀、雜質(zhì)G、雜質(zhì)J依次出峰，與相鄰峰均能達(dá)到很好地分離。

已知雜質(zhì)B、D、E、F、G、H、I、M的校正因子不在0.9～1.1范圍內(nèi)，參照文獻(xiàn)[15]，建議將已知雜質(zhì)訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，按外標(biāo)法計(jì)算、質(zhì)控限度為0.1%；未知雜質(zhì)按自身對(duì)照法、0.1%的限度進(jìn)行控制。