精準醫(yī)療時代病理學研究生分子病理教學的探索

羅韜，姚小紅，葛佳，時雨，閻曉初

作者單位：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院病理學研究所，重慶400038

精準醫(yī)療（Precision Medicine）是基于個體化醫(yī)療的理念，將最新的分子遺傳學成果和生物信息學大數(shù)據(jù)分析應用到臨床診療中的新型醫(yī)學模式。最初是在2011年提出，2015年1月20日，美國前總統(tǒng)奧巴馬提出“精準醫(yī)學計劃”，財政預算計劃在2016年撥付2.15億美元用于相關研究和技術發(fā)展[1]。中國也在2016年加快了精準醫(yī)學的步伐，國家發(fā)改委批復在全國建設27個基因檢測技術應用示范中心；中國的華大基因也在2017年發(fā)布了基于SBS策略的自主研發(fā)測序儀BGISEQ500，沖擊著外企壟斷的測序上游[2]。而這些改變，也給病理學這一經(jīng)典學科的發(fā)展帶了挑戰(zhàn)和機遇。

病理學，特別是診斷病理學，實際上是最早踐行精準醫(yī)療的學科[3]。在二十世紀七十年代，基于辣根過氧化物酶的免疫組化（Immunohistochemistry）技術就已發(fā)明并廣泛用于腫瘤的輔助病理分型，而不同的腫瘤分型所應用的治療方法也完全不同[4]。隨著測序技術的不斷發(fā)展，基因圖譜的改變越來越受到人們的重視。2016年，中華醫(yī)學會病理學分會分子病理學組成立，標志著分子病理在病理診斷中的正式崛起?，F(xiàn)在的病理醫(yī)師不能再局限于“形態(tài)病理為主，分子病理為輔”的理念，而是“兩手抓兩手都要硬”。將包括蛋白改變（免疫組化），基因突變，染色體異常等分子生物學內(nèi)容納入到病理學的框架中，形成全新的分子病理學[5]。未來的病理人案頭除了《病理醫(yī)師實用組織學》《診斷病理學》以外，還應有《分子診斷與腫瘤個體化治療原則》等最新分子診斷用書。把最新的成果應用到臨床病理診斷中，才能在精準醫(yī)療的浪潮中乘風破浪，砥礪前行。

病理學專業(yè)的研究生，是未來活躍在病理一線的診斷病理醫(yī)師。組織病理的學習，已經(jīng)形成完整的教學模式，包括理論授課，臨床實踐等內(nèi)容[6-7]。而分子病理的教學內(nèi)容，一直停留在理論部分的學習，缺乏實踐操作內(nèi)容；內(nèi)容上多參考分子生物學的章節(jié)劃分，主要集中信號通路的介紹，而忽略了臨床治療與病理診斷的聯(lián)系[8]。精準醫(yī)療的迅猛發(fā)展，要求分子病理的教學模式進一步更新，才能培養(yǎng)出符合新時代需要的病理醫(yī)師，才能在分子病理亞?？平ㄔO上貢獻力量。

1 分子病理的理論教學

分子病理作為分子生物學與病理學的交叉學科，廣義上講，只要研究疾病發(fā)展過程中分子水平的功能和機制，都屬于分子病理學。但是作為目標是培養(yǎng)病理醫(yī)師的分子病理教學，這樣的范圍過于寬泛。每年都有許多高影響力期刊報道某分子或者分子通路在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，從細胞核到細胞膜，從腫瘤細胞到免疫細胞，但是能真正走到臨床治療，走進WHO病理分型指南的屈指可數(shù)[9-10]。因此，分子病理的理論授課，應該基于在臨床治療以及病理診斷的應用，以這些成功臨床應用的案例，給研究生講解分子生物學與病理學的結合如何推動精準醫(yī)療的發(fā)展。此外，結合本單位的研究工作，給研究生展示如何運用分子生物學的工具去解釋一個臨床治療或診斷的具體科學問題，培養(yǎng)研究生的科研思維，也是理論授課應該涵蓋的內(nèi)容。

1.1 與臨床治療結合 靶向藥物的發(fā)展，是精準醫(yī)療時代最為重要的助推器之一。隨著赫賽丁和利妥昔單抗的臨床應用，越來越多的靶向藥物如雨后春筍般涌現(xiàn)出來。而臨床靶向治療的運用，關鍵在于是否有靶點基因的改變。以腫瘤領域患病人數(shù)第一的非小細胞肺癌為例，其NCCN指南已將EGFR激酶抑制劑作為一線用藥，而EGFR是否突變是應用EGFR激酶抑制劑的關鍵指標[11]。類似的例子還有許多，如赫賽丁僅用于HER2陽性的乳腺癌病人，伊馬替尼用于KIT/PDGFRA突變的胃腸間質(zhì)瘤病人，伊馬替尼用于費城染色體陽性的白血病病人[12-13]。而相應的突變就需要利用組織石蠟樣本進行基因突變檢測，可以說，分子病理的診斷報告是病人是否可以使用靶向藥物的金標準。此外，一些基因的突變對于化療藥物的敏感性也有影響，如膠質(zhì)瘤中MGMT甲基化狀態(tài)影響病人對替莫唑胺的敏感性。因此，在分子病理教學中，應該強化臨床治療相關內(nèi)容，按照不同的靶點分子進行章節(jié)分類，完整地展示該靶點從科研發(fā)現(xiàn)到臨床應用，讓學生從實際的例子感受精準醫(yī)療時代的歷史性變革。

1.2 與診斷病理結合 臨床病理診斷是病理科的核心價值，上個世紀的病理診斷主要依靠病理醫(yī)生的“火眼金睛”，直到免疫組化技術的出現(xiàn)，我們可以通過一些蛋白指標，輔助進行病理分型及鑒別診斷。比如非小細胞肺癌中的腺癌的主要標記是細胞角蛋白7（Cytokeratin 7，CK7），甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（Thyroid Transcription Factor-1，TTF-1）；鱗癌的主要標記是細胞角蛋白5/6（Cytokeratin 5/6，CK5/6），腫瘤蛋白P63（Tumor Protein P63，P63）。但是由于免疫組化的表達并不是“有”和“無”的差別，而是“多”和“少”的區(qū)分。所用試劑、抗體、操作流程的不同，在免疫組化判讀上存在差別，這就難以將免疫組化作為診斷的關鍵標準，而只能作為輔助診斷的工具。而基因?qū)用娴母淖?，包括點突變，染色體缺失等，檢測重復性好，不同檢測方法一致性高。2016年，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤WHO分型標準推翻了沿用了幾十年的組織病理分型系統(tǒng)，將分子改變（IDH點突變，1p/19q聯(lián)合缺失，H3K27M突變等）納入到膠質(zhì)瘤分型標準中，并明確指出，若組織病理形態(tài)與分子病理診斷不符，以分子病理診斷為準[14]?？梢哉f將分子病理診斷提到了組織病理同樣的高度。我們有理由相信，隨著大規(guī)模腫瘤測序工作的完成，會有越來越多的癌種將分子病理納入其WHO分型標準中。因而在課程設置上，可以按照癌種進行章節(jié)設置，參考腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的多平臺大規(guī)模測序結果，介紹最新的分子病理的發(fā)展情況（如肝癌，結直腸癌，肺癌），以及已寫入WHO分型標準的案例（如膠質(zhì)瘤，髓母細胞瘤），讓學生們切身感受到分子病理的發(fā)展對病理診斷工作的影響。

1.3 與科研熱點結合 如果說病理診斷是病理科的核心價值，那么科研工作就是病理科最好的“名片”。雖然“唯SCI論”確實存在一定的問題，但是目前各大高校的研究生教育體系中，SCI論文是硬指標[15]。分子病理作為病理學發(fā)展的前沿陣地，不斷產(chǎn)生基礎科研和臨床科研的創(chuàng)新性成果，是培養(yǎng)研究生科研能力的最佳平臺。分子病理的教學工作，還應該以科室已畢業(yè)研究生的工作為基礎，培養(yǎng)研究生的科研思維，引導研究生發(fā)現(xiàn)自己的研究方向。為后續(xù)的科研實踐打下堅實的基礎。

2 分子病理的實踐教學

理論聯(lián)系實際，是共產(chǎn)黨最基本的原則之一，分子病理的教學上也不例外。實踐是理解檢測基因突變原理，掌握高通量測序質(zhì)控，激化科研創(chuàng)新思維的重要途徑。分子病理實踐教學的目的，在于讓研究生在操作的過程中一步一步的掌握操作流程中每個步驟的目的，并且理解分子病理是如何將分子生物學的最新技術與病理學結合起來。研究生通過實際操作才能掌握一份基因檢測報告的“烹飪”過程，并聯(lián)系理論課的內(nèi)容，設計一份科研課題書。這種聯(lián)系理論的實踐教學，必定能讓研究生對分子病理的理解更加深刻。課程安排按照病理科開展的平臺分類，可以分為以下四部分。

2.1 聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reac?tion，PCR） PCR是分子病理檢測平臺中應用最為成熟的，研究生在以往的分子生物學的課程中也有接觸，相對來說容易接受。按照從易到難的教學原則，將PCR平臺的內(nèi)容安排在前面，讓研究生從熟悉的領域開始。在實驗原理講授部分就可以強調(diào)檢測突變所用的探針法與以往檢測表達量所用的染料法的區(qū)別，避免造成誤解；在實際操作中，讓研究生動手操作，強調(diào)操作上的小細節(jié)，提高研究生的動手能力。在操作空隙，應結合PCR技術講解其在病理診斷以及臨床用藥中的意義，使學員認識到PCR技術與分子病理的區(qū)別所在。

2.2 熒光原位雜交（Fluorescence in Situ Hybrid?ization，F(xiàn)ISH） FISH是將DNA探針用熒光標記，特異性檢測目的DNA序列在切片的定位，定性和半定量分析[16]?？梢栽粰z測DNA擴增（如HER2，TOP2A），染色體缺失（1p/19q），基因斷裂（EWSR1，F(xiàn)KHR）以及基因融合（BCL2/IGH，EML4/ALK）。目前，針對點突變的熒光探針正在研發(fā)中。FISH是病理科常用的分子病理平臺，也是分子病理與其他分子生物學平臺最大的不同之處。FISH的結果判斷，需要結合鏡下形態(tài)，這就需要研究生具備扎實的組織病理學知識。而其相對PCR而言，操作更為復雜，流程中的細節(jié)對結果影響較大，這就要求研究生需要嚴格按照步驟說明進行，才能獲得理想的檢測結果。

2.3 測序 測序可以說是現(xiàn)今分子病理操作要求最高的平臺，包括sanger測序，二代測序都需要五個工作日以上才能出具檢測報告。研究生對測序的了解還僅僅停留在概念階段，大致了解基本原理，對具體細節(jié)及目的并不清楚，更不用說二代測序數(shù)據(jù)處理時的生物信息學分析。因而測序部分主要以研究生觀摩操作為主，教學的目的是讓研究生了解測序每個步驟在整個實驗中的作用，幫助研究生建立測序的知識框架。

2.4 科研課題設計 分子病理的科研課題大致分為兩類：基礎科研和臨床科研。基礎科研主要關注分子在疾病發(fā)展過程中的功能，機制，主要運用體外細胞模型和動物模型；臨床科研主要探索分子靶標在臨床病理診斷中的意義，主要運用臨床樣本和統(tǒng)計學分析。前者原創(chuàng)性強，但是需要分子生物學實驗平臺并投入大量時間精力；后者臨床應用價值高，但需要臨床樣本的長時間積累。研究生通過研讀文獻，尋找尚未解決的實際診斷問題，如毛細胞型膠質(zhì)瘤的BRAF-KIAA1549融合突變率較高[17]，而目前尚無FISH探針；肝細胞肝癌中TERT突變率達40%以上[18]，而肝臟是血流豐富的臟器，是否可以將ctDNA中的TERT突變作為早診和復發(fā)的血清學標志。通過具體課題的實踐，掌握科研工作中會用到的統(tǒng)計學方法，檢測原理和論文寫作技巧，完成研究生階段對于科研能力的訓練和培養(yǎng)。

3 展望

精準醫(yī)學時代的到來，給整個醫(yī)學界帶來了前所未有的沖擊，許多學科都在重塑[19]。分子病理作為病理學科在精準醫(yī)學時代的前沿，決定了未來病理學科在醫(yī)學中的地位，是挑戰(zhàn)，更是機遇[20]。研究生教育是學科發(fā)展的基石，現(xiàn)在的博士、碩士，以后就是學科發(fā)展方向的領航員。分子病理教學的好與壞，直接影響了新一代病理人的理念和思維方式。只有基礎結合臨床，理論聯(lián)系實踐，才能將分子診斷的理念深深扎根于研究生腦中，才能培養(yǎng)出符合精準醫(yī)學時代要求的病理學科人才。

利益沖突 作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 羅韜：提出設計思路、實施項目及撰寫論文；姚小紅：修訂思路及實施項目；時雨：審校論文；葛佳，閻曉初：指導項目實施