苯醚甲環(huán)唑、咯菌腈、噻蟲嗪混用對大豆病蟲害的毒力及作物安全性研究

金 立，龔國斌，葛亮亮，湯忠祥，李 文，胡華海，張幫林

(安徽豐樂農化有限責任公司，合肥 230016)

大豆根腐病(Fusarium oxysporum)是由尖孢鐮刀菌引起的一種重要大豆病害，主要發(fā)生在大豆根部，幼苗或成株均染病。受害株根系不發(fā)達，根瘤少，地上部矮小瘦弱，葉色淡綠，分枝、結莢明顯減少[1]。小地老虎(Agrotis ypsilon)，又名土蠶，切根蟲，是我國重要的農業(yè)害蟲，種類多且食性雜，對大豆幼苗危害很大，輕則造成缺苗斷壟，重則毀種重播，直接關系到大豆產量和質量[2]。因此，尋找一種對兩者具有優(yōu)良防治效果的藥劑進行合理混配是一種很好的選擇。

苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)對子囊菌、擔子菌和半知菌等引起的多種病害有持久的保護和治療活性，既可以用作葉面處理劑，又可以用作種子處理劑[3]?？┚?fludioxonil)可用于種子處理防治谷物及其他作物上的多種病害[4]。噻蟲嗪(Thiamethoxam)是一種全新結構的第2代煙堿類高效低毒殺蟲劑，對害蟲具有胃毒、觸殺及內吸活性，對地下害蟲具有較好的防治效果[5]。本試驗開展了不同配比的噻蟲嗪、咯菌腈與苯醚甲環(huán)唑混劑分別對大豆根腐病和大豆小地老虎的聯(lián)合作用及其對作物的安全性評價研究，以期為混配制劑的研發(fā)及田間應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌與試蟲

大豆根腐病菌由安徽農業(yè)大學病理實驗室提供。

小地老虎：在成蟲發(fā)生期在田間用黑光燈誘捕成蟲，將成蟲移入養(yǎng)蟲籠內，置于溫度(25±1)℃條件下，以糖水或蜂蜜液飼養(yǎng)。養(yǎng)蟲籠內放入供產卵的白紙、紗布等，每天收集1次卵。將收集的卵置于溫度(25±1)℃條件下待其孵化，將初孵幼蟲置于養(yǎng)蟲盒內，用新鮮的寄主植物飼養(yǎng)至3齡，備用。

1.1.2 供試藥劑

98%噻蟲嗪原藥(江蘇輝豐農化股份有限公司)；97%咯菌腈原藥(江蘇云帆化工有限公司)；95%苯醚甲環(huán)唑原藥(江蘇七洲綠色化工股份有限公司)；24%苯醚·咯·噻蟲種子處理懸浮劑(安徽豐樂農化有限責任公司)。

1.1.3 供試作物

大豆品種：冀豆17、中黃37、皖豆28。

1.1.4 試驗儀器

FA1004A型電子天平(上海力辰儀器科技有限公司)；人工氣候箱(青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司)；生物培養(yǎng)箱(常州金壇良友儀器有限公司)；可控日光溫室(12 h/12 h光暗交替、光照強度8 000～30 000 lx、溫度15～26 ℃，相對濕度65%～80%)，系青州暉耀溫室工程有限公司建。

1.2 試驗方法

首先篩選苯醚甲環(huán)唑與咯菌腈防治大豆根腐病菌的最佳配比，然后以此最佳配比組合與噻蟲嗪進行混配篩選出對害蟲的最適配方。

1.2.1 苯醚甲環(huán)唑與咯菌腈防治大豆根腐病菌的配比篩選設計

在預試驗基礎上，用電子天平準確稱取適量咯菌腈和苯醚甲環(huán)唑原藥，用少量丙酮溶解定容獲得單劑母液。將咯菌腈和苯醚甲環(huán)唑及兩者5種不同配比組合分別用0.1%吐溫80水溶液稀釋配制成 5個濃度梯度溶液待用。苯醚甲環(huán)唑與咯菌腈的比例設置如下：3∶1、1∶0.6、1∶1、0.6∶1、1∶3。

1.2.2 噻蟲嗪與苯醚甲環(huán)唑-咯菌腈最佳組合對小地老虎的配比篩選設計

根據1.2.1試驗結果選擇苯醚甲環(huán)唑與咯菌腈(B)的最佳增效組合開展與噻蟲嗪(A)不同混配比例的篩選，具體比例設置如下：噻蟲嗪∶苯醚甲環(huán)唑及咯菌腈組合的配比分別為 22.8∶1.2、22.6∶1.4、22.4∶1.6、22.2∶1.8、22.0∶2.0。

藥劑溶解及梯度設置方法同1.2.1。

1.2.3 生物活性測定方法

⑴ 大豆根腐病菌

采用含毒培養(yǎng)基法[6]：在無菌操作條件下，將預先融化冷卻至約50 ℃的滅菌PSA培養(yǎng)基定量加入滅菌劃線三角瓶中，使培養(yǎng)基與劃線處(60 mL)平齊，然后從低濃度到高濃度依次吸取600 μL藥液，分別加入上述三角瓶中，充分搖勻，然后等量倒入4個培養(yǎng)皿(Φ 9 cm)中，制成5個濃度梯度帶藥平板，并設含等量丙酮的空白對照。挑選長勢均勻良好的菌種進行接種。在無菌條件下用直徑為5 mm的打孔器，自菌落邊緣同一圓周上切取菌餅(保證供試病菌的菌齡相同)，用接種器將菌餅接入培養(yǎng)皿的含藥培養(yǎng)基中央，菌絲面朝下，蓋上皿蓋，于(25±1)℃培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)。根據空白對照皿中菌絲生長情況，用卡尺測量菌落直徑。每個菌落采用十字交叉法垂直測量，取其平均值，計算抑菌率。將菌絲生長抑制機率值(Y)與藥劑濃度對數(shù)值(x)進行線性回歸分析，求出回歸方程、EC50及其95%置信限。

菌餅直徑和菌絲生長抑制率的計算公式如下：

式中：D為菌落增長直徑(cm)；D1為菌落直徑(cm)；D2為菌餅直徑(cm)。

式中：I為菌絲生長抑制率(%)；D0為空白對照菌落增長直徑(cm)；Dt為藥劑處理菌落增長直徑(cm)。

2種或2種以上農藥混配的聯(lián)合毒力作用方式采用共毒系數(shù)或增效系數(shù)進行評價，其計算公式如下[8]：

當 CTC≥120，表示增效作用；CTC≤80時，表示拮抗作用；80＜CTC＜120時，表示相加作用。當殺菌劑對昆蟲的毒力或殺蟲劑對病原菌的毒力很低，可作為增效劑S看待，其毒力可以忽略不計。因此在計算殺菌劑與殺蟲劑混用的共毒系數(shù)時，此時共毒系數(shù)又稱為增效系數(shù)，其計算簡化為：

⑵ 大豆小地老虎

采用混藥飼料喂食法并稍改進，即種子包衣的形式進行無限量取食法[7]。將供試原藥或其不同混配組合以丙酮為溶劑加 5%木質素磺酸鈉作為分散劑，2%十二烷基磺酸鈉作為潤濕劑，再加入一定量的水配制成一定質量濃度的藥液，分別用不同等比用量對大豆種進行拌種，并晾干形成6個藥劑梯度的大豆種子進行種植。24%苯醚甲環(huán)唑·咯菌腈·噻蟲嗪種子處理懸浮劑直接按不同等比用量進行包衣。97%咯菌腈原藥、95%苯醚甲環(huán)唑原藥按最高用量進行拌種。以不含原藥成分的配制藥液最高量進行拌種作為空白對照。

選擇適宜小地老虎生活的沙壤土，過850 μm篩，用遠紅外快速干燥器在120 ℃下消毒處理4 h。在消毒后的土中加入適量水，使土壤含水量約18%。將一定量的該土裝入養(yǎng)蟲盒內，放入供試大豆種子100粒作為食物，并覆蓋一定量的土。每處理4次重復，每重復試蟲30頭。

將處理后的養(yǎng)蟲盒置于溫度為 24 ℃的實驗室中飼養(yǎng)。每天用小型噴霧器對養(yǎng)蟲盒表層土進行適量噴水，保持土壤濕度。7 d后檢查試蟲死亡情況(死亡標準：蟲體明顯收縮或觸之不能正常爬行)，并計算死亡率。如對照死亡率小于10%，根據試蟲校正死亡率機率值(Y)及劑量對數(shù)(x)用Excel軟件計算各藥劑的毒力回歸方程和LC50。

死亡率和校正死亡率分別按式(3)和式(4)計算：

式中：P1為死亡率(%)；K為死亡蟲數(shù)(頭)；N為處理總蟲數(shù)(頭)。

式中：P2為校正死亡率(%)；Pt為處理死亡率(%)；P0為空白對照死亡率(%)。

若對照死亡率＜5%，無需校正；對照死亡率為5%～20%，應按公式(4)進行校正；對照死亡率＞20%，試驗需重做。

1.2.4 作物安全性試驗方法

⑴ 發(fā)芽試驗

采用玻皿法[8]。試驗設 3個施藥劑量處理，即24%苯醚·咯·噻蟲種子處理懸浮劑劑量分別為120 g a.i./100 kg(1)、240 g a.i./100 kg(2)、480 g a.i./100 kg(3)以及清水對照(4)，將種子包衣后，放在兩層濾紙間，噴灑一定量水使濾紙潤濕，放入塑封袋，25 ℃恒溫持續(xù)光照培養(yǎng)，每天噴灑一定量水，保持濾紙濕潤，處理5、10 d后分別測定發(fā)芽勢，每個處理4次重復。

⑵ 出苗試驗

采用盆栽法。將營養(yǎng)一致、土壤孔隙度相似及含水量在60%左右的土壤裝于花盆(90 mm×80 mm×65 mm)中，把經不同濃度藥劑(藥劑劑量設置同發(fā)芽試驗)包衣處理后的種子分別播種于土壤表面，覆土5 mm，毎處理4次重復，毎重復75粒種子，25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)。藥后20 d，觀察大豆植株形態(tài)和葉片顏色，播種20 d后，以莖基部與根部的結合部為節(jié)點，按根系/莖葉部分開，分別測定其新生長度。

⑶ 生長速率抑制率

生長速率按式(5)計算，生長速率抑制率按式(6)計算：

式中：R為生長速率，mm/d；L為植株新生長度，mm；D為時間，d。

式中：I為生長速率抑制率(%)；Rck為空白對照組生長速率(%)；Rt為藥劑處理組生長速率(%)。

1.2.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據處理采用Excel和DPS7.05軟件處理計算差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 室內配比篩選

苯醚甲環(huán)唑與咯菌腈的不同配比組合對大豆根腐病菌的聯(lián)合作用不同(表1)。由表1可見，當苯醚甲環(huán)唑與咯菌腈的配比為3∶1、0.6∶1和1∶3時，其對大豆根腐病菌的毒力表現(xiàn)為相加作用，其共毒系數(shù)分別為115.74、102.69和99.36，而當苯醚甲環(huán)唑與咯菌腈的配比為1∶1和1∶0.6時，其對大豆根腐病菌的毒力表現(xiàn)為增效作用，其共毒系數(shù)分別為138.17和125.32，其中以1∶1混配組合的增效作用最明顯。因此，確定該配比為苯醚甲環(huán)唑與咯菌腈的最佳混配組合。

將苯醚甲環(huán)唑和咯菌腈最佳配比(1∶1)混劑(B)與噻蟲嗪(A)按不同配比混配防治大豆小地老虎和大豆根腐病菌結果見表2和表3。

從表2可以看出，噻蟲嗪對大豆小地老虎具有較高的活性，LC50為1.086 1 mg/L，加入不同含量的殺菌劑苯醚甲環(huán)唑和咯菌腈(1∶1)混劑后，對大豆小地老虎的LC50為1.138 3～1.411 4 mg/L，與噻蟲嗪單劑對大豆小地老虎的活性差異不明顯，說明苯醚甲環(huán)唑和咯菌腈對噻蟲嗪的殺蟲活性無明顯影響，其中，當噻蟲嗪(A)與B按22.4∶1.6混配時，LC50與噻蟲嗪單劑LC50最接近，為1.138 3 mg/L，可作為3種藥劑防治大豆小地老虎的最適配比。

從表3可以看出，苯醚甲環(huán)唑和咯菌腈0.8∶0.8混劑對大豆根腐病菌具有較高的活性，EC50為0.578 4 mg/L。加入不同配比的殺蟲劑噻蟲嗪后，對大豆根腐病菌的EC50為0.618 2～0.770 3 mg/L，與苯醚甲環(huán)唑和咯菌腈0.8∶0.8混劑對大豆根腐病菌的活性差異不明顯。因此，噻蟲嗪對苯醚甲環(huán)唑和咯菌腈混劑的抑菌活性無明顯影響。其中，當噻蟲嗪(A)與B按22.4∶1.6混配時，EC50與苯醚甲環(huán)唑和咯菌腈0.8∶0.8混劑的EC50最接近，為0.618 2 mg/L，可作為3種藥劑防治大豆根腐病菌的最適配比。

綜上所述，當噻蟲嗪、咯菌腈和苯醚甲環(huán)唑按22.4∶0.8∶0.8比例混配時，對大豆小地老虎和大豆根腐病菌的活性為所有配比組合中最高，且與噻蟲嗪對小地老虎以及咯菌腈和苯醚甲環(huán)唑混劑對大豆根腐病菌的活性最接近。因此，將其用于田間防治大豆小地老虎和大豆根腐病具有合理性。

表1 苯醚甲環(huán)唑與咯菌腈不同配比組合對大豆根腐病菌的聯(lián)合毒力

表2 苯醚甲環(huán)唑、咯菌腈與噻蟲嗪的不同混配組合對大豆小地老虎的活性

表3 苯醚甲環(huán)唑、咯菌腈與噻蟲嗪的不同混配組合對大豆根腐病菌的活性

2.2 作物安全性試驗

2.2.1 24%苯醚·咯·噻蟲種子處理懸浮劑對大豆發(fā)芽的影響

由表4可知，供試的3個品種大豆種子對照發(fā)芽勢、發(fā)芽率接近且均較高，經 24%苯醚·咯·噻蟲種子處理懸浮劑對大豆種子包衣后，當藥種比為1∶200，即藥劑用量為120 g a.i/100 kg，當藥種比為1:100，即藥劑用量為240 g a.i/100 kg時，3種大豆種子發(fā)芽勢都在 80%以上，發(fā)芽率都在 94%以上。除處理3外，處理1，2與對照相比均差異不顯著。綜合結果表明，24%苯醚·咯·噻蟲懸浮種衣劑以使用量120 g a.i/100 kg和240 g a.i/100 kg對大豆種子包衣后，不影響大豆最終發(fā)芽率；當種衣劑使用量為480 g a.i/100 kg，即藥種比1∶50時，大豆種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率有所降低。

表4 24%苯醚·咯·噻蟲種子處理懸浮劑對大豆種子發(fā)芽的影響

2.2.2 24%苯醚·咯·噻蟲種子處理懸浮劑對大豆出苗的影響

用藥20 d后，藥種比例為480 g a.i/100 kg時，冀豆17、中黃37、皖豆28生長抑制率超過10%。其余藥劑處理對葉片和植株均無不良影響，未出現(xiàn)葉片褪綠、黃化，植株形態(tài)正常，無畸形等癥狀，生長抑制率均在5%以下。

3 結 論

室內藥效配方篩選測定結果表明，噻蟲嗪與苯醚甲環(huán)唑及咯菌腈按 22.4∶0.8∶0.8比例混配時，對大豆小地老虎和大豆根腐病菌的活性為所有配比中最高，和噻蟲嗪對大豆小地老虎以及苯醚甲環(huán)唑和咯菌腈混劑對大豆根腐病菌的活性相當，且其生產成本也較低。同時，可一次施藥達到病蟲兼治的效果，符合田間病蟲害復合發(fā)生的自然規(guī)律，且可大大降低勞動力成本，在田間推廣具有較好的市場前景。

表5 24%苯醚·咯·噻蟲種子處理懸浮劑對大豆出苗的影響(盆栽試驗20 d結果)

通過不同濃度 24%苯醚·咯·噻蟲種子處理懸浮劑包衣對3種大豆品種安全性研究表明，24%苯醚·咯·噻蟲種子處理懸浮劑在藥種比為120 g a.i./100 kg和240 g a.i./100 kg時不影響大豆種子的發(fā)芽、出苗和生長，說明此產品在以上劑量范圍和試驗條件下對大豆安全，可作為推薦劑量在田間示范推廣。至于田間安全性，有待于田間試驗進一步的驗證。