HPLC測(cè)定櫻桃咯菌腈的殘留量研究

張雪丹，楊娟俠，辛 力，王明林，連玉晶，劉 濤

（1.山東省果樹(shù)研究所，山東泰安 271000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271000；3.山東黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266000）

咯菌腈（Fludioxonil），化學(xué)名稱4-（2,2-二氟-1,3-苯并間二氧-4-基吡咯-3-腈），商品名為Saphire，Celest或適樂(lè)時(shí)[1]。該產(chǎn)品是1984年由瑞士Ciba-Geigy公司（現(xiàn)先正達(dá)公司）開(kāi)發(fā)的苯基吡咯類殺菌劑，對(duì)防治根腐病、青枯病、莖基腐病等疾病具有顯著效果，可廣泛應(yīng)用于棉花、小麥、花生、大豆、水稻等多種作物種子的處理上[2-4]?？┚孀鳛橐环N新型的低毒低殘留仿生殺菌劑，對(duì)果蔬采后貯藏保鮮過(guò)程中產(chǎn)生的綠霉、青霉、干腐病、灰霉菌等也有很好的防治效果，已有其在柑橘、蘋(píng)果、馬鈴薯、草莓、葡萄、石榴等果蔬應(yīng)用的品質(zhì)保持和安全性檢測(cè)等研究報(bào)道[5-10]。

分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 分子結(jié)構(gòu)

最大殘留限量Maximum residue limits（MRL） 是某一種化學(xué)殘留物在特定食品中合法的或可被接受的最高含量，單位是mg/kg，是食品安全檢驗(yàn)的重要指標(biāo)。美國(guó)、加拿大、澳大利亞、新西蘭、歐盟等均允許將咯菌腈用于果蔬采后殺菌保鮮處理，但各方對(duì)最大殘留限量MRL的規(guī)定不一。其中，美國(guó)、澳大利亞和新西蘭規(guī)定核果類（桃、櫻桃、杏等）MRL為5.0 mg/kg；加拿大規(guī)定菠蘿MRL為20 mg/kg，柑橘類果實(shí)為10 mg/kg，西紅柿為5 mg/kg；歐盟規(guī)定葉菜類MRL為20 mg/kg。目前，我國(guó)尚未準(zhǔn)許咯菌腈用于果蔬采后殺菌保鮮，山東營(yíng)養(yǎng)源食品科技有限公司已向農(nóng)業(yè)部提交此方面的申請(qǐng)。

山東省果樹(shù)研究所果品貯藏保鮮課題組自2016年以來(lái)一直開(kāi)展咯菌腈對(duì)櫻桃貯藏保鮮品質(zhì)及安全性研究。研究發(fā)現(xiàn)，櫻桃經(jīng)咯菌腈處理后不僅可以大大降低果實(shí)貯藏期腐爛率，還在保持果實(shí)硬度和果梗色澤和降低果實(shí)凹陷率等方面具有良好的效果。但咯菌腈處理后的果實(shí)食用安全性是其應(yīng)用的前提，咯菌腈殘留量是評(píng)價(jià)其安全性能最重要的指標(biāo)之一。因此，利用高效液相色譜法（HPLC） 測(cè)定不同處理的櫻桃咯菌腈的殘留量，為咯菌腈在果蔬貯藏保鮮應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)條件與方法

1.1 試驗(yàn)原料

櫻桃，品種為“紅燈”，2016年5月和2017年5月采于山東省泰安市新泰區(qū)宮里櫻桃園，八九成熟，去除病蟲(chóng)害、畸形果等。果實(shí)為現(xiàn)采果，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行咯菌腈浸泡處理。

LC-20A型液相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品。

乙腈（色譜級(jí)）、咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)品（含量99.5%）、氯化鈉（NaCl）和無(wú)水硫酸鎂（MgSO4），均為分析純；實(shí)驗(yàn)用咯菌腈（含量50.0%），由美國(guó)先正達(dá)公司生產(chǎn)提供。

1.2 色譜操作條件

色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈∶水（75∶25，V∶V），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，進(jìn)樣體積20.0 μL?？筛鶕?jù)不同的儀器適當(dāng)調(diào)整操作參數(shù)，以獲得最佳分析效果。

1.3 咯菌腈處理櫻桃方法

1.3.1 果面水分對(duì)櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量的影響

取100個(gè)櫻桃果，分別用含量為200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s，然后裝盒，或者用衛(wèi)生紙將果面水分擦干后裝盒，再用HPLC測(cè)咯菌腈殘留量，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 不同浸泡時(shí)間咯菌腈處理櫻桃果實(shí)的殘留量

取100個(gè)櫻桃果，分別用含量為200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡不同時(shí)間（10，20，30，40，50，60 s）后裝盒，用HPLC測(cè)咯菌腈殘留量，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 不同含量咯菌腈處理櫻桃果實(shí)的殘留量

取100個(gè)櫻桃果，分別用不同含量（100，200，300 mg/kg） 的咯菌腈溶液浸泡20 s，然后吸干果面水分后裝盒，用HPLC測(cè)咯菌腈殘留量，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

當(dāng)腔長(zhǎng)L為λ/8的奇數(shù)倍，即L=(2m+1)λ/8時(shí)干涉光強(qiáng)達(dá)到最大值；當(dāng)腔長(zhǎng)L為λ/8的偶數(shù)倍時(shí)，也即L=2mλ/8時(shí)干涉光強(qiáng)最小.這兩種情況下的輸出信號(hào)都是非線性的，系統(tǒng)的靈敏度最低.而在信號(hào)曲線斜率最大的位置，光強(qiáng)信號(hào)的線性最好，此時(shí)系統(tǒng)的靈敏度也最高.因此在采用F-P干涉檢測(cè)微懸臂的偏移時(shí)，將參考點(diǎn)設(shè)置在信號(hào)線性斜率最大的位置，即圖4中所示的Q點(diǎn).將該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的F-P干涉儀腔長(zhǎng)定義為參考點(diǎn)腔長(zhǎng)，F(xiàn)-P干涉儀工作之前的腔長(zhǎng)定義為初始腔長(zhǎng)，微懸臂偏移時(shí)的腔長(zhǎng)定義為工作腔長(zhǎng).

1.3.4 水沖洗對(duì)櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量的影響

取100個(gè)櫻桃果，用含量為200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s，然后用水沖洗5 min再吸干果面水分后裝盒，測(cè)咯菌腈殘留量，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)。

2 試驗(yàn)步驟

2.1 標(biāo)樣溶液的配制

稱取標(biāo)樣1.00 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶，加入乙腈超聲波處理10 min，然后定容為100 mg/L的標(biāo)樣溶液。用0.45 μm濾膜過(guò)濾至玻璃LC小瓶中，進(jìn)行HPLC分析。

標(biāo)樣溶液液相色譜見(jiàn)圖2。

圖2 標(biāo)樣溶液液相色譜

2.2 櫻桃樣品HPLC測(cè)定預(yù)處理

處理后的樣品果去核，然后低溫破碎，快速稱取樣品10.00 g于50 mL玻璃具塞離心管，加入10.00 mL乙腈，超聲提取15 min，再加入1.00 g氯化鈉和4.00 g無(wú)水硫酸鎂（MgSO4），渦旋1 min，隨后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5.0 min；取1.00 mL上清液，同時(shí)加入100.00 mg MgSO4和10.00 mg石墨碳（GCB），渦旋30 s；上清液過(guò)0.45 μm濾膜至玻璃LC小瓶中，濾液進(jìn)行HPLC分析。

2.3 樣品測(cè)定

根據(jù)上述方式處理樣品，待高效液相色譜儀平穩(wěn)后按順序進(jìn)樣檢測(cè)。

2.4 計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為C標(biāo)，HPLC所測(cè)得的咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積為A標(biāo)，HPLC所測(cè)得的試樣溶液的咯菌腈峰面積為A樣，則試樣中咯菌腈的質(zhì)量濃度C樣（mg/L） 按下式計(jì)算：

式中：V樣——標(biāo)樣溶液的體積，L；

m樣——櫻桃試樣的質(zhì)量，kg。

每個(gè)樣品做3次重復(fù)，咯菌腈的殘留量X均為3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果平均值，以X±RSD（%）表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 果面水分對(duì)櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量的影響

櫻桃果實(shí)采后最好經(jīng)低溫水預(yù)冷處理以降低果實(shí)溫度、減少果面附著的灰塵與病菌等，預(yù)冷水處理后的果面和果梗處有細(xì)微的殘存水珠，生產(chǎn)上若是直接銷售時(shí)是不對(duì)殘存水珠做吸干處理的。試驗(yàn)櫻桃經(jīng)低溫咯菌腈溶液浸泡處理后直接裝盒測(cè)定，或者對(duì)果面水分進(jìn)行吸干處理，以此來(lái)判斷果面殘存液對(duì)櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量的影響。測(cè)定發(fā)現(xiàn)，櫻桃經(jīng)低溫咯菌腈溶液浸泡處理后直接裝盒的果實(shí)咯菌腈殘留量為1.997 mg/kg±6.94%，而經(jīng)咯菌腈溶液浸泡處理后對(duì)果面水分進(jìn)行吸干處理的果實(shí)咯菌腈殘留量為0.161 mg/kg±0.22%，即經(jīng)咯菌腈溶液浸泡后殘存的果面水分對(duì)櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量影響很大，建議用咯菌腈溶液處理櫻桃果實(shí)后進(jìn)行水分吸干處理以降低咯菌腈殘留量。但無(wú)論是否進(jìn)行水分吸干處理，200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s后櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量均低于5.00 mg/kg。

3.2 浸泡時(shí)間對(duì)櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量的影響

課題組研究發(fā)現(xiàn)，用100 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s處理櫻桃果實(shí)就可以減少果實(shí)掉柄率、保持果實(shí)色澤、降低果實(shí)腐爛率和延長(zhǎng)果實(shí)保鮮期。研究發(fā)現(xiàn)，增加咯菌腈溶液含量（100～600 mg/kg） 不會(huì)對(duì)櫻桃果實(shí)產(chǎn)生傷害。試驗(yàn)用含量為200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡櫻桃果實(shí)不同時(shí)間（10，20，30，40，50，60 s），以此研究浸泡時(shí)間對(duì)櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量的影響。

不同浸泡時(shí)間的櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量見(jiàn)表1。

表1 不同浸泡時(shí)間的櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量

由表1可知，隨著咯菌腈溶液浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，櫻桃果實(shí)咯菌腈的殘留量逐漸升高。在不擦干果面殘留液的情況下，200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡60 s處理櫻桃果實(shí)的咯菌腈的殘留量為4.276 mg/kg±0.22%，低于5.00 mg/kg。因此，建議在保證咯菌腈殺菌及保持果實(shí)品質(zhì)效果的情況下，櫻桃果實(shí)在咯菌腈溶液中的浸泡時(shí)間越短越好。

3.3 不同含量咯菌腈處理櫻桃果實(shí)的殘留量

通過(guò)檢測(cè)100，200，300 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s后果實(shí)的咯菌腈殘留量，用以確定咯菌腈溶液含量對(duì)櫻桃咯菌腈殘留量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，100 mg/kg咯菌腈溶液浸泡20 s后果實(shí)的咯菌腈殘留量為0.161 9±4.72%，200 mg/kg咯菌腈溶液處理的咯菌腈殘留量為0.161 mg/kg±0.22%，300 mg/kg咯菌腈溶液處理的咯菌腈殘留量為0.169 mg/kg±8.84%。由此可知，進(jìn)行水分吸干處理的前提下，不同含量的咯菌腈溶液（100～300 mg/kg） 浸泡處理櫻桃20 s后果實(shí)的咯菌腈殘留量幾乎相同，即咯菌腈含量對(duì)短時(shí)浸泡櫻桃果實(shí)的咯菌腈殘留量的影響較少。

3.4 水沖洗對(duì)櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量的影響

咯菌腈溶液短時(shí)浸泡即可殺滅附著在櫻桃果面的病菌，為了盡可能少地降低果實(shí)咯菌腈殘留量，測(cè)定了櫻桃經(jīng)咯菌腈溶液浸泡后在自來(lái)水中沖洗5 min后的咯菌腈殘留量，研究水沖洗對(duì)咯菌腈殘留量的影響。結(jié)果表明，櫻桃果實(shí)經(jīng)含量為200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s后用水沖洗5 min再吸干果面水分后的咯菌腈殘留量為0.003 1 mg/kg±16.64%，而未經(jīng)水沖洗的櫻桃咯菌腈殘留量為0.161 mg/kg±0.22%，即櫻桃經(jīng)咯菌腈溶液浸泡后再用水沖洗可大大降低櫻桃果實(shí)咯菌腈的殘留量。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，建議櫻桃果實(shí)采后預(yù)冷分級(jí)時(shí)先用咯菌腈溶液短時(shí)浸泡處理降低櫻桃果面的病菌和灰塵，再用預(yù)冷水沖洗櫻桃以降低果溫和果實(shí)表面殘存的咯菌腈。

4 結(jié)論

試驗(yàn)建立了利用HPLC檢測(cè)櫻桃咯菌腈的殘留量分析方法，研究了咯菌腈溶液浸泡櫻桃時(shí)果面水分、浸泡時(shí)間、溶液濃度及浸泡后水沖洗處理對(duì)櫻桃果實(shí)咯菌腈殘留量的影響。結(jié)果表明，咯菌腈溶液處理櫻桃果實(shí)后吸干果面水分處理可大大降低咯菌腈殘留量；隨著咯菌腈溶液浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，咯菌腈殘留量逐漸升高，但咯菌腈濃度對(duì)短時(shí)浸泡櫻桃的咯菌腈殘留量影響較少。同時(shí)，咯菌腈溶液處理后再用水沖洗櫻桃也可降低果實(shí)咯菌腈的殘留量。所有檢測(cè)結(jié)果表明，櫻桃經(jīng)咯菌腈處理后的殘存量很低，均未超過(guò)國(guó)外果蔬關(guān)于咯菌腈最大殘留量的標(biāo)準(zhǔn)，可以安全食用。