濃縮蘋果汁中微生物染菌的種類及防治研究

王 楠，臧汝瑛，周宏霞

（威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東威海 264209）

蘋果是我國(guó)廣泛栽培的一種水果，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。蘋果中的營(yíng)養(yǎng)成分及功能性成分種類眾多，有糖類、果膠、纖維素、有機(jī)酸、單寧及各種金屬離子，具有補(bǔ)中益氣、開胃制酸、潤(rùn)肺悅心等功效[1]。在我國(guó)，蘋果除了部分鮮食外，大部分通過(guò)蒸發(fā)濃縮或者膜分離加工成濃縮蘋果汁，進(jìn)而制作成各種飲料[2]。

濃縮蘋果汁的終點(diǎn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為40%～50%，目的是為了便于運(yùn)輸，以及增加滲透壓不容易染菌[3]。然而，微生物染菌僅僅是相對(duì)的，在濃縮蘋果汁的運(yùn)輸及貯藏過(guò)程中，出現(xiàn)酒味的現(xiàn)象往往意味著其中有了微生物在發(fā)酵，如果不能及時(shí)加工成產(chǎn)品，酒味會(huì)轉(zhuǎn)變成酸味，甚至不良的臭味[4]。微生物染菌現(xiàn)象在炎熱的夏季尤為嚴(yán)重，一直是果汁工業(yè)要努力解決的難題。試驗(yàn)對(duì)濃縮蘋果汁中的微生物進(jìn)行了分離培養(yǎng)，確定了容易染菌的種類，并對(duì)其防治措施進(jìn)行了初步研究，對(duì)于濃縮果汁的保鮮具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

濃縮蘋果汁，購(gòu)于威海農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；納他霉素，由浙江新銀象生物工程有限公司提供；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、焦亞硫酸鈉等試劑，均為分析純。

瓊脂培養(yǎng)基[5]：葡萄糖10 g/L，酵母抽提物2 g/L，胰蛋白胨5 g/L，瓊脂20g/L，初始pH值7.0。于121℃條件下滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果汁中微生物的培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中傾倒瓊脂平板，備用。用移液槍吸取濃縮蘋果汁200 μL涂布平板，槍頭事先滅菌并用脫脂棉包口。平板倒扣于恒溫培養(yǎng)箱中，于35℃條件下培養(yǎng)36 h，觀察平板菌落情況。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)微生物并顯微鏡觀察[6]

用接種環(huán)挑取單菌落2環(huán)至滅菌的液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的成分與瓊脂培養(yǎng)基相同，但不含瓊脂。于35℃條件下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間24 h。培養(yǎng)完畢后吸取1滴菌液置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在10×40倍的顯微鏡下觀察微生物的形態(tài)。

1.2.3 焦亞硫酸鈉對(duì)酵母菌的抑制效果[7]

液體培養(yǎng)基滅菌后，吸取不同量的焦亞硫酸鈉濃溶液至搖瓶中，使其總使用量分別為300×10-6，500×10-6，1 000×10-6，再接種1 mL的酵母菌液作為種子，并以不加焦亞硫酸鈉作為對(duì)照，于35℃條件下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間24 h，觀察酵母菌的增殖情況。

1.2.4 納他霉素對(duì)酵母菌的抑制效果[8]

液體培養(yǎng)基滅菌后，吸取不同量的納他霉素濃溶液至搖瓶中，使其總使用量分別為2×10-6，5×10-6，10×10-6，再接種1 mL的酵母菌液作為種子，并以不加納他霉素作為對(duì)照，于35℃條件下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間24 h，觀察酵母菌的增殖情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃縮蘋果汁中微生物的平板培養(yǎng)

根據(jù)濃縮蘋果汁的貯藏時(shí)間，先后取樣進(jìn)行了微生物的培養(yǎng)，其貯藏時(shí)間分別為7，15，30，50 d。首先從氣味方面考查，貯藏7 d的果汁沒(méi)有明顯的酒味，也沒(méi)有異味，但是在培養(yǎng)微生物的平板上仍然有菌落生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1（a），而且在平板上卻產(chǎn)生了明顯的酒精味，說(shuō)明染菌大部分是酵母菌，同時(shí)也有少量霉菌生長(zhǎng)出來(lái)，且通過(guò)平板計(jì)數(shù)，酵母菌數(shù)量占比約80%。貯藏了15 d的果汁，生長(zhǎng)出的酵母數(shù)量要比7 d的多，見(jiàn)圖1（b），約為600個(gè)/mL，基本上全是酵母菌，霉菌沒(méi)有生長(zhǎng)出來(lái)。而對(duì)于存放30 d和50 d的蘋果汁，其酒精味很濃烈，說(shuō)明酵母菌增殖到了一定程度，已經(jīng)嚴(yán)重引起了果汁的質(zhì)變，微生物培養(yǎng)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，酵母菌數(shù)量高達(dá)3 000個(gè)/mL，見(jiàn)圖1（c） 和圖1（d）。

從濃縮蘋果汁中培養(yǎng)出的微生物菌落見(jiàn)圖1。

2.2 搖瓶培養(yǎng)濃縮蘋果汁中的微生物

圖1 從濃縮蘋果汁中培養(yǎng)出的微生物菌落

將平板上的部分單菌落接種至搖瓶中進(jìn)行液體培養(yǎng)，以觀察微生物的類型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從蘋果汁中分離出來(lái)的微生物增殖能力很強(qiáng)。由圖2（a） 可知，剛剛接種菌液時(shí)的液體培養(yǎng)基依然很清亮透明，說(shuō)明微生物的數(shù)量還比較少，然而僅僅經(jīng)過(guò)了24 h的培養(yǎng)，各個(gè)搖瓶中的培養(yǎng)基變得非常渾濁，見(jiàn)圖2（b），OD值從初始的0.4急劇升高至42.5。果汁中染菌微生物的增殖能力強(qiáng)，也從側(cè)面證實(shí)了控制果汁保鮮的難度較大。

搖瓶培養(yǎng)微生物的增殖情況見(jiàn)圖2。

圖2 搖瓶培養(yǎng)微生物的增殖情況

從搖瓶培養(yǎng)基的氣味考查，每瓶都散發(fā)著濃濃的酒精味，還夾雜一些其他芳香氣味，但是每瓶中的氣味也有差異。通過(guò)顯微鏡觀察，基本確定染菌的大多數(shù)是酵母菌，但是酵母菌的種類和形態(tài)并不單一。

顯微鏡觀察搖瓶中微生物的形態(tài)見(jiàn)圖3。

圖3 顯微鏡觀察搖瓶中微生物的形態(tài)

由圖3可知，有的酵母菌呈橢球狀，見(jiàn)圖3（a）；有的呈球形，見(jiàn)圖3（b）；有的呈長(zhǎng)桿狀或者節(jié)狀，見(jiàn)圖3（c）。對(duì)于圖3（d），其中的微生物種類繁多，呈絲狀的是霉菌，大球形的是酵母菌，而非常細(xì)小的呈點(diǎn)狀的則為細(xì)菌類?？傊?，通過(guò)對(duì)濃縮果汁中染菌微生物的調(diào)研，可以得知其中數(shù)量最多的是酵母菌，占總菌落數(shù)的80%；霉菌數(shù)量次之，占15%；而細(xì)菌類數(shù)量最少，占5%。

2.3 焦亞硫酸鈉對(duì)酵母菌的抑制作用

既然清楚了濃縮蘋果汁容易染菌，也對(duì)其中的微生物種類進(jìn)行了調(diào)研，接下來(lái)對(duì)濃縮果汁的防腐保鮮作了進(jìn)一步研究。目前，果汁在運(yùn)輸及貯藏中常用的抑菌劑是焦亞硫酸鈉（簡(jiǎn)稱焦亞）。焦亞的化學(xué)式是Na2S2O5，是一種酸性物質(zhì)，一般認(rèn)為其防腐抑菌機(jī)理是與水反應(yīng)放出SO2，進(jìn)而生成亞硫酸[9]。根據(jù)GB 2760對(duì)于焦亞的使用規(guī)定，焦亞在果蔬汁中的最大使用量為0.05 g/kg，濃縮果蔬汁按濃縮倍數(shù)折算，估算約250×10-6。為了確定焦亞是否對(duì)濃縮果汁中的酵母菌有抑制效果，研究對(duì)其使用量進(jìn)行了試驗(yàn)[10]。

不同焦亞硫酸鈉使用量對(duì)酵母菌的抑制作用見(jiàn)圖4。

圖4 不同焦亞硫酸鈉使用量對(duì)酵母菌的抑制作用

由圖4可知，焦亞的使用量分別為0，300×10-6，500×10-6，1 000×10-6，接種酵母菌經(jīng)過(guò) 24 h培養(yǎng)后，對(duì)照組（0） 搖瓶中的菌液非常渾濁，OD值為46.3。焦亞使用量為300×10-6的試驗(yàn)組，從外觀上看與對(duì)照組區(qū)別不大，OD值為42.7，說(shuō)明焦亞幾乎沒(méi)有發(fā)揮出抑菌作用。當(dāng)焦亞使用量達(dá)到500×10-6時(shí)，試驗(yàn)組搖瓶的OD值為38.2，雖然能夠體現(xiàn)出其對(duì)酵母菌有所抑制，但很明顯抑菌效果并不強(qiáng)烈。甚至當(dāng)焦亞使用量高達(dá)1 000×10-6時(shí)，OD值也只是降低至21.6，遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到試驗(yàn)預(yù)期的抑菌效果。這實(shí)際上是我國(guó)食品工業(yè)中防腐劑使用的一個(gè)縮影，即在國(guó)標(biāo)規(guī)定的范圍內(nèi)，很多防腐劑達(dá)不到理想的抑菌效果[11]。

2.4 納他霉素對(duì)酵母菌的抑制作用

納他霉素是一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)的防腐劑，其專一性的抑制酵母和霉菌，具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，與乳酸鏈球菌素、聚賴氨酸一起稱為三大生物型防腐劑[12]。根據(jù)我國(guó)GB 2760規(guī)定，納他霉素可以應(yīng)用于干酪、肉制品、糕點(diǎn)、果蔬汁等食品的防腐中，在果蔬汁中的使用量最高為0.3 g/kg，即300×10-6；在發(fā)酵酒中的使用量最高為0.01 g/L，即10×10-6。為了確定納他霉素是否對(duì)濃縮果汁中的酵母菌有抑制效果，研究對(duì)其使用量進(jìn)行了試驗(yàn)[13]。

不同納他霉素使用量對(duì)酵母菌的抑制作用見(jiàn)圖5。

圖5 不同納他霉素使用量對(duì)酵母菌的抑制作用

由圖5可知，納他霉素的使用量分別為0，2×10-6，5×10-6，10×10-6，接種酵母菌經(jīng)過(guò) 24 h培養(yǎng)后，對(duì)照組（0） 搖瓶中的菌液非常渾濁，OD值為44.8。納他霉素使用量為2×10-6的試驗(yàn)組，從外觀上看與對(duì)照組有明顯不同，還是呈現(xiàn)剛接種時(shí)澄清的狀態(tài)，其OD值從初始的0.45僅僅增長(zhǎng)至0.84，說(shuō)明納他霉素對(duì)酵母菌的抑制作用非常強(qiáng)烈，僅僅2×10-6就達(dá)到了理想的效果。后續(xù)2個(gè)試驗(yàn)組，使用納他霉素5×10-6和10×10-6的搖瓶中，酵母菌同樣也沒(méi)有繁殖起來(lái)，OD值分別為0.82和0.78。這說(shuō)明納他霉素可以作為濃縮蘋果汁保鮮的有效防腐劑。

3 結(jié)論

濃縮蘋果汁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為40%～50%，鑒于濃縮技術(shù)及質(zhì)量指標(biāo)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)不能再高，因此相比于果葡糖漿或者麥芽糖漿75%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，濃縮果汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低。而且由于蘋果汁中含量較高，大部分糖分為葡萄糖、果糖、蔗糖等，均為易發(fā)酵成分[14]，所以在運(yùn)輸及貯藏過(guò)程中容易發(fā)生染菌。研究發(fā)現(xiàn)，濃縮蘋果汁中染菌微生物絕大多數(shù)為酵母菌，少數(shù)為霉菌，而細(xì)菌類數(shù)量較少。針對(duì)于酵母菌和霉菌，研究選擇了專一性的抑菌劑納他霉素，使用量?jī)H僅2×10-6即表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的抑菌作用和防腐效果，這就為濃縮果汁的保鮮提供了有效的解決方案。此外，從應(yīng)用成本角度考慮，納他霉素的市場(chǎng)價(jià)格以500元/kg計(jì)算，即使按照5×10-6的使用量，每1 m3果汁中納他霉素的使用量為5 000 mg，即5 g，折合成本為2.5元/m3，這對(duì)于果汁工業(yè)是很容易接受的。而且，納他霉素作為一種安全、高效的食品防腐劑，將會(huì)在食品工業(yè)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[15]。