miR-34a-5p及AKT1基因在子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及其對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響

馮婉琴，鄧月秀，馬穎*

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510282；2桂林市婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣西桂林 541001

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)是一種依賴雌激素的慢性良性婦科疾病，能夠引起不孕、痛經(jīng)、盆腔疼痛等癥狀，在育齡期婦女中發(fā)病率較高，且易復(fù)發(fā)[1-2]。EM是具有種植生長、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等類似惡性腫瘤特點(diǎn)的良性疾病，盡管病因?qū)W說很多，但其發(fā)病機(jī)制至今仍然不明確[3]。

微小RNA(miRNA)是一組具有18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)中起著十分重要的作用。miRNA通常表現(xiàn)出與其靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)不完全結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解或抑制翻譯[4-5]。相關(guān)研究闡述了miRNA在多種細(xì)胞過程中的關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡、自噬和血管形成[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤(如肺癌、肝癌、乳腺癌等)的發(fā)生可能與miRNA的失調(diào)有關(guān)[7-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在EM患者子宮內(nèi)膜組織中呈低表達(dá)[14]， 通過靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p與絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)基因關(guān)聯(lián)密切。本研究旨在分析miR-34a-5p和AKT1在EM患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及其對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(ESC)遷移及侵襲的 影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1月-2019年6月因子宮肌瘤、子宮腺肌癥等良性婦科疾病在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科行子宮切除術(shù)的患者91例，根據(jù)術(shù)中情況及術(shù)后病理結(jié)果分為EM組(n=68)與非EM組(n=23)。在無菌操作下將離體子宮迅速剖開并刮取內(nèi)膜，一部分用甲醛液固定，常溫保存用于免疫組化及原位雜交檢測，另一部分置于預(yù)冷的PBS液中并迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室行原代細(xì)胞分離及培養(yǎng)。所有患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 子宮內(nèi)膜組織中miR-34a-5p、AKT1基因表達(dá)水平檢測

1.2.1 原位雜交法檢測miR-34a-5p表達(dá)水平 將子宮內(nèi)膜組織石蠟包埋切片(厚4 μm)用4%甲醛固定，經(jīng)3% H2O2處理后，用蛋白酶K(2 μg/ml)于37 ℃處理30 min，洗滌后37 ℃預(yù)雜交2 h。與含地高辛標(biāo)記的探針雜交、洗滌，接著與堿性磷酸酶偶聯(lián)的綿羊抗地高辛抗Fab片段孵育1 h。室溫下按原位雜交試劑盒說明書操作，并觀察分析結(jié)果。

1.2.2 免疫組化法檢測AKT1表達(dá)水平 將子宮內(nèi)膜組織石蠟包埋切片(厚4 μm)在100%二甲苯中脫蠟，并用乙醇和水進(jìn)行水化。在100 ℃檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)(2 min)。用含有3% H2O2及血清的封閉試劑來封閉特異性抗原，然后在4 ℃下與ANGPT2抗體(美國芝加哥Proteintech公司)1:500孵育過夜。洗滌后，將切片與生物素標(biāo)記的兔抗山羊抗體和辣根過氧化物酶在室溫下孵育15 min。使用3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，在DAB緩沖液底物中進(jìn)行過氧化物酶反應(yīng)。采用DAB顯色并用蘇木精復(fù)染，中性樹膠封閉加蓋玻片。使用明視場顯微鏡對(duì)玻片進(jìn)行分析。

1.3 原代細(xì)胞的提取、分離、培養(yǎng)及鑒定 取4%甲醛固定好的子宮內(nèi)膜組織，PBS漂洗3次，用無菌眼科剪剪碎組織并加入3 ml Ⅰ型膠原酶(1 mg/ml)， 37 ℃消化60 min，每15 min攪拌一次。然后將混合細(xì)胞懸液經(jīng)200目及400目不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，濾液為ESC懸液；接著將篩網(wǎng)反置于另一皿上，用DMEM/F-12培養(yǎng)基反洗篩網(wǎng)回收腺上皮細(xì)胞(endometrial epithelial cell，EEC)。將ESC及EEC接種于直徑3 cm的培養(yǎng)皿，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至約60%豐度。加入0.3% Triton-X-100，37 ℃孵育30 min增加細(xì)胞膜通透性后置于4%甲醛固定30 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉20 min，接著加入人波形蛋白和人角蛋白抗體，4 ℃孵育過夜。采用0.3% Triton-X-100及PBS各洗滌2次后分別加入相應(yīng)二抗，于37 ℃孵育60 min。最后加入100 μl 4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)，孵育15 min后沖洗，甘油封片，共聚焦倒置熒光顯微鏡觀察。

1.4 細(xì)胞模型的構(gòu)建及分組 將ESC培養(yǎng)在含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，收集生長狀況良好且處于對(duì)數(shù)生長期的ESC置于6孔板中進(jìn)行細(xì)胞接種，細(xì)胞數(shù)量控制在3×105個(gè)/孔，使用脂質(zhì)體-3000將miR-34a-5p mimic及陰性對(duì)照RNA(miR-NC)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建miR-34a-5p mimic組及miR-NC組細(xì)胞模型，繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率 將miR-34a-5p mimic組及miR-NC組的ESC懸液100 μl分別接種于96孔板(3000～5000個(gè)/孔)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12、24、48 h后分別加入CCK-8溶液10 μl，在酶標(biāo)儀上測定450 nm波長處的光密度(OD)值，并計(jì)算兩組的細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將miR-34a-5p mimic組和miRNC組的ESC細(xì)胞接種于6孔板(約5×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞豐度達(dá)95%以上時(shí)，用槍頭在板中垂直劃痕后用PBS洗滌3次，加入無血清培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間觀察并記錄細(xì)胞遷移情況。任意選取6～8條水平線，通過Image J軟件計(jì)算各細(xì)胞間的距離。

1.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室中加入基質(zhì)膠，待其聚合形成凝膠后，上室放入無血清培養(yǎng)基重懸的miR-34a-5p mimic組及miR-NC組ESC細(xì)胞懸液各200 μl，下室放入600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后小心取出上室，用線拴住并做好標(biāo)記，使用中性甲醛固定、1%結(jié)晶紫染色后置于顯微鏡下計(jì)算兩組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)。

1.8 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬能力檢測 按照細(xì)胞凋亡試劑盒(中國康為世紀(jì)公司)的操作步驟，首先在miR-34a-5p mimic組及miR-NC組的ESC細(xì)胞沉淀中加入緩沖液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至5 ml流式管中，避光加入5 μl Annexin Ⅴ/FITC和10 μl PI，室溫下孵育0.5 h后，在流式細(xì)胞儀中分析。采用RTPCR法檢測miR-34a-5p mimic組及miR-NC組ESC中LC3自噬基因表達(dá)水平。收集各組ESC細(xì)胞，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書步驟提取細(xì)胞RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行上機(jī)檢測，U6及β-actin為內(nèi)參照，引物序列由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EM組與非EM組子宮內(nèi)膜組織中miR-34a-5p、AKT1陽性表達(dá)率的比較 miR-34a-5p及AKT1均為胞質(zhì)染色(圖1)。EM組子宮內(nèi)膜組織中miR-34a-5p陽性表達(dá)率低于非EM組(16.2%vs. 82.6%)，而AKT1陽性表達(dá)率高于EM組(72.1%vs. 30.4%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=34.323、12.581，P＜0.001)。

圖1 EM組和非EM組中miR-34a-5p(原位雜交法)和AKT1(免疫組化法)表達(dá)情況Fig.1 Expressions of miR-34a-5p (in situ hybridization) and AKT1 (immunohistochemical method) in EM and non-EM group

2.2 ESC的培養(yǎng)與鑒定 培養(yǎng)24 h后，ESC呈梭形或多角形，大概2 d后細(xì)胞生長活躍，6～7 d即可鋪滿培養(yǎng)皿，傳代后3～5 d可鋪滿，10代以內(nèi)細(xì)胞形態(tài)基本不變。EEC呈蝌蚪形，培養(yǎng)48 h呈漩渦狀，3 d后開始加速生長，呈大細(xì)胞集落狀生長，5～6 d融合成片狀，7 d左右出現(xiàn)脂質(zhì)空泡，細(xì)胞開始崩解。免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示，基質(zhì)細(xì)胞為波形蛋白陽性，而上皮細(xì)胞為角蛋白陽性(圖2)。

2.3 miR-34a-5p mimic組與miR-NC組不同時(shí)間點(diǎn)的ESC增殖率比較 miR-34a-5p mimic組培養(yǎng)12、24、48 h后的細(xì)胞增殖率(分別為42.25%±7.80%、33.75%±6.70%、24.50%±3.87%)均明顯低于miR-NC 組(分別為92.50%±6.76%、80.00%±5.29%、70.25%±4.99%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為9.735、10.832、14.483，P＜0.001，圖3)。

2.4 miR-34a-5p mimic組與miR-NC組ESC的遷移能力比較 miR-34a-5p mimic組的細(xì)胞遷移能力(3 0.6 7%±4.0 4%)明顯低于m i R-N C 組(65.00%±5.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.25，P＜0.05)。

2.5 miR-34a-5p mimic組與miR-NC組ESC的侵襲能力比較 結(jié)晶紫染色檢測結(jié)果顯示，miR-34a-5p mimic組細(xì)胞侵襲能力[(32.3±6.1)個(gè)]明顯低于miR-NC組[(88.0±8.5)個(gè)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.179，P＜0.05，圖4)。

圖2 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(ESC)和腺上皮細(xì)胞(EEC)免疫熒光雙染色(×200)Fig.2 Flurescent images of cytokeratin and vimentin expressed in EEC and ESC (Immunofluorescence double staining, ×200)

圖3 miR-34a-5p mimic組與miR-NC組不同時(shí)間點(diǎn)的ESC增殖率比較Fig.3 Proliferation rate of ESCs in miR-34a-5p mimic group and miR-NC group

2.6 miR-34a-5p mimic組與miR-NC組ESC的凋亡及自噬能力比較 miR-34a-5p mimic組的細(xì)胞凋亡率(18.00%±2.00%)明顯高于miR-NC組(9.33%±3.51%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.714，P=0.021，圖5)。miR-34a-5p mimic組的LC3自噬基因表達(dá)水平(0.39±0.03)明顯高于miR-NC組(0.19±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.02，P＜0.05)。

3 討 論

EM的病因眾說紛紜，然而其發(fā)病機(jī)制尚不明確，發(fā)病率高且容易復(fù)發(fā)[15-16]，具有種植生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等腫瘤特性，使得學(xué)界經(jīng)常將其發(fā)病機(jī)制與腫瘤相聯(lián)系和比較[17]。近年來很多相關(guān)研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。李鵬等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在膀胱癌組織

圖4 miR-34a-5p mimic組與miR-NC組ESC的侵襲能力比較(結(jié)晶紫染色 ×400)Fig.4 Invasion ability of ESCs in miR-34a-5p mimic group and miR-NC group (crystal violet staining, ×400)

中的表達(dá)水平降低，miR-34a-5p mimics提高了膀胱癌細(xì)胞中miR-34a-5p的表達(dá)水平，并且降低膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。魏麗瓊等[19]在研究胃癌的發(fā)病機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在胃癌組織中以高表達(dá)為主，且miR-34a-5p的高表達(dá)與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。本課題組前期通過基因芯片測序發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在EM患者中呈現(xiàn)低表達(dá)[14]， 本研究通過原位雜交的方法，在組織水平進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-34a-5p在EM患者的子宮內(nèi)膜組織中陽性表達(dá)率較低，由此推測miR-34a-5p對(duì)EM的發(fā)生發(fā)展可能存在一定的負(fù)性調(diào)控作用。

圖5 miR-34a-5p mimic組與miR-NC組ESC的凋亡率比較Fig.5 The apoptosis rate of ESCs in miR-34a-5p mimic group and miR-NC group

miRNA可能是通過某個(gè)靶基因來影響疾病的發(fā)生發(fā)展的[20]。本研究團(tuán)隊(duì)早期通過多個(gè)靶基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miR-34a-5p靶基因的預(yù)測，在檢索大量文獻(xiàn)后，AKT1基因引起了本課題組的關(guān)注。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有3個(gè)家族成員，分別是AKT1、AKT2和AKT3，其中AKT1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[21-23]。石琴琴等[24]研究發(fā)現(xiàn)，AKT1在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá)，抑制AKT1蛋白的表達(dá)可影響癌細(xì)胞的增殖及凋亡，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及發(fā)展。章諾貝等[25]研究發(fā)現(xiàn)可通過AKT1途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞的體外增殖及侵襲力，從而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。越來越多的研究表明，AKT1與腫瘤密切相關(guān)[26]，因而本研究大膽假設(shè)AKT1與EM的發(fā)生發(fā)展也存在一定的關(guān)系。本研究從組織水平通過免疫組化的方法檢測EM組及非EM組的子宮內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)，EM組的AKT1陽性表達(dá)率較高，這與AKT1的調(diào)控機(jī)制相一致。由此更有理由相信AKT1與EM的發(fā)病機(jī)制存在關(guān)聯(lián)，并推測這種關(guān)聯(lián)是由miR-34a-5p通過靶向AKT1的途徑實(shí)現(xiàn)的。此外，AKT是一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中心，有100多個(gè)下游靶基因，可影響細(xì)胞的代謝、生長、凋亡及增殖等功能。Wu等[27]發(fā)現(xiàn)，miR-377-5p可通過靶向AKT1抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲，調(diào)控細(xì)胞周期分布。王金燕等[28]探討淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-185可通過靶向作用于AKT1基因而抑制Jurkat細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-34a-5p表達(dá)后，ESC的增殖、侵襲、遷移能力較非EM組明顯下降，而凋亡能力及自噬能力明顯升高。這些細(xì)胞能力都是腫瘤病灶形成、病情發(fā)展和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中不可或缺的。

綜上所述，miR-34a-5p與AKT1基因在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，且miR-34a-5p可能通過靶向AKT1基因來影響ESC的增殖、遷移、侵襲、凋亡及自噬功能，進(jìn)而影響EM的發(fā)病，為臨床上治療EM提供了新的靶點(diǎn)與研究方向。