兩種檢測方法評價ACS患者服用氯吡格雷后的血小板反應(yīng)性 及其與CYP2C19基因多態(tài)性的關(guān)系

梅竹，侯智為,2，才藝，趙曉杰，田孝祥，劉晶，劉丹，閆承慧*

1北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科/全軍心血管病研究所，沈陽 110016；2錦州醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧錦州 121001

采用氯吡格雷行抗血小板聚集治療是經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)患者術(shù)后抗血栓的首選方案[1]。目前越來越多的研究結(jié)果顯示，部分患者服用氯吡格雷后的抗血小板聚集效果不佳，仍存在血小板高反應(yīng)性(high on-treatment platelet reactivity，HTPR)，這將導(dǎo)致血栓復(fù)發(fā)、支架內(nèi)血栓、心肌梗死、卒中或死亡等不良事件的發(fā)生風(fēng)險增加[2-4]。

影響氯吡格雷抗血小板聚集治療效果的因素較多[5]。研究顯示，CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷的藥物反應(yīng)性密切相關(guān)[6]。但是，CYP2C19基因型對服用氯吡格雷的患者具有何種影響，不同基因型患者的抗血小板聚集治療方案該如何制定等問題還需要檢測患者的血小板功能后才能確定。血小板功能檢測方法較多且標(biāo)準(zhǔn)不一，國內(nèi)還沒有專門的指南(共識)來規(guī)范血小板功能檢測。在我國氯吡格雷用藥患者中，關(guān)于血小板反應(yīng)性與CYP2C19基因型多態(tài)性的關(guān)系以及CYP2C19基因多態(tài)性是否會影響其用藥后的血小板反應(yīng)性尚無定論[7-8]。為明確流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板內(nèi)血管擴(kuò)張型刺激磷酸化蛋白(vasodilator stimulated phosphoprotein，VASP)法與光比濁(light transmittance aggregometry，LTA)法測量的血小板反應(yīng)性與基因型的關(guān)系，以及不同檢測方法間的相關(guān)性，本研究分別使用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和花生四烯酸(arachidonicacid，AA)誘導(dǎo)的光比濁法(ADP-LTA和AA-LTA)以及VASP法檢測43例PCI患者采用氯吡格雷抗血小板聚集治療的效果，并研究這些檢測結(jié)果與CYP2C19基因型的關(guān)系，評價不同血小板檢測方法在臨床用藥中的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年7-10月在北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院參與血小板反應(yīng)性與臨床血栓事件研究(PARCTICE研究)的患者43例。男30例，女13例，年齡(59.9±8.9)歲，體重指數(shù)(BMI)為(25.36±3.57) kg/m2。患者均明確診斷為急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)，接受了PCI治療且正在服用阿司匹林(100 mg/d)和氯吡格雷(300 mg/d)，排除合并使用其他抗血小板聚集藥物及嚴(yán)重進(jìn)展性疾病(如惡性腫瘤)者。所有參與者均簽署知情同意書。本研究通過北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 觀察指標(biāo) 使用基因芯片技術(shù)，根據(jù)患者CYP2C19等位基因型將患者分為快代謝型(extensive metabolizer，EM)CYP2C19*1/*1(636 GG，681 GG)；中等代謝型(intermediate metabolizer，IM)CYP2C19*1/*2(636 GG，681 GA)；慢代謝型(poor metabolizer，PM)CYP2C19*2/*2(636 GG，681 AA)。其中攜帶CYP2C19*2型等位基因者(即IM型和PM型)定義為CYP2C19功能缺陷。服藥72 h后，抽取患者靜脈血2 ml，在北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍心血管病研究所使用VASP法、ADP-LTA法、AA-LTA法評估血小板反應(yīng)性。血小板功能測試均在抽血后4 h內(nèi)完成。

1.3 指標(biāo)分析 比較3種基因型患者臨床特征的差異以及不同血小板檢測方法與基因型的差異性；根據(jù)不同血小板檢測方法結(jié)果的75%位點將43例患者分為血小板高反應(yīng)性(high on-treatment platelet reactivity，HTPR，11例)及非高反應(yīng)性(non high ontreatment platelet reactivity，nHTPR，32例)，比較血小板反應(yīng)性的差異；比較3種血小板檢測方法檢測結(jié)果間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。連續(xù)變量以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，結(jié)果有差異時進(jìn)一步比較采用Bonferroni檢驗；采用Pearson相關(guān)分析不同血小板檢測方法結(jié)果的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同CYP2C19基因型患者的臨床特征指標(biāo)比較 本研究43例患者中，CYP2C19基因型為EM型17例(39.5%)、IM型19例(44.2%)、PM型7例(16.3%)。PM型、IM型患者的VASP檢測結(jié)果均高于EM型患者，PM型患者的AA-LTA法檢測結(jié)果高于IM型及EM型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。血小板反應(yīng)性與CYP2C19基因型分析結(jié)果顯示，VASP法中PM型與EM型患者、IM型與EM型患者檢測結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；AA-LTA法中EM型與PM型患者、IM型與PM型患者檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

2.2 不同CYP2C19基因型患者的血小板反應(yīng)性比較 由VASP法和AA-LTA法檢測的HTPR比例大小均為PM型>IM型>EM型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ADP-LAT法檢測的3種基因型的HTPR比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表1 不同CYP2C19基因型患者的臨床特征比較Tab.1 Clinical characteristics of patients with different CYP2C19 genotypes

2.3 3種血小板檢測方法檢測結(jié)果間的相關(guān)性

AA-LTA法與ADP-LTA法的檢測結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.496，P<0.001)，AA-LTA法與VASP法結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.383，P=0.011)，ADP-LTA法與VASP法結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.369，P=0.014，圖2)。

圖1 血小板反應(yīng)性檢測結(jié)果與CPY2C19基因多態(tài)性的差異性箱式圖Fig.1 Boxplot of the difference between platelet reactivity and CPY2C19 gene polymorphism

表2 不同CYP2C19基因型患者的血小板反應(yīng)性比較Tab.2 Platelet reactivity in patients with different CYP2C19 genotypes

3 討 論

本研究使用兩種血小板反應(yīng)性檢測方法(VASP法和LTA法)評估43例ACS患者PCI后使用氯吡格雷的抗血小板聚集效果與CYP2C19基因型間的關(guān)系，同時評估VASP法與LTA法檢測血小板功能的相關(guān)性。本研究所有患者中攜帶CYP2C19基因缺陷型(IM型與PM型基因)患者的比例為60.5%(26/43)，高于歐美國家(29.1%～30.8%)[9-10]，與幾項關(guān)于亞洲人的研究結(jié)果較一致(43.4%～62.0%)[11-13]。

本研究結(jié)果顯示，患者血小板反應(yīng)性受CYP2C19基因多態(tài)性的影響。VASP法及AA-LTA法檢測的HTPR比例大小均為PM型>IM型>EM型，提示針對氯吡格雷抗血小板聚集治療患者進(jìn)行CYP2C19基因型檢測的必要性；對CYP2C19基因缺陷的患者應(yīng)格外關(guān)注其服用氯吡格雷藥物期間的血小板反應(yīng)性。臨床上應(yīng)針對不同基因型患者制定個性化的抗血小板聚集治療方案，以降低PCI后血栓等不良事件的發(fā)生率。

圖2 3種血小板檢測方法檢測結(jié)果間的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis among the results of three methods for platelet detection

由于血小板有多種激活途徑[14-15]，不同的血小板功能檢測方法可以通過不同的原理反映血小板的反應(yīng)性，但目前尚無結(jié)論表明任何一種血小板檢測方法具有絕對的優(yōu)勢[16-17]。每種檢測方法只能從單一角度評價血小板功能，均有自身的優(yōu)點及缺陷。例如，血小板受到刺激后會分泌含有ADP的致密顆粒，隨后刺激嘌呤能受體P2Y12。VASP是一種細(xì)胞內(nèi)血小板蛋白，VASP磷酸化表示P2Y12受體被抑制。使用流式細(xì)胞儀測定VASP水平，能夠特異性地反映P2Y12的表達(dá)及激活狀態(tài)。但檢測VASP水平很耗時，并且需要經(jīng)驗豐富的實驗室人員來操作[18]。 血小板活化還可使磷脂酶A2活化，從而釋放出AA。AA隨后將通過環(huán)氧合酶(COX)轉(zhuǎn)化為前列腺素H2(PGH2)，然后將其轉(zhuǎn)化為血栓烷A2(TXA2)。TXA2將穿過血小板膜并與前列腺素受體(TP)結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)血小板活化。LTA法人工添加血小板激活誘導(dǎo)劑AA或ADP使血小板活化?；罨蟮难“寰奂?，使血液的透光度增加，通過測量透光度反映血小板凝聚力。LTA法是最早被認(rèn)可，也是使用最廣泛的血小板功能檢測方法。但是該方法的誘導(dǎo)劑劑量使用不一致，并受操作時間、溫度等影響，難以在不同實驗室進(jìn)行統(tǒng)一檢測[19]。

患者CYP2C19基因型屬于遺傳特征，基本不受外界因素影響。本研究發(fā)現(xiàn)，通過VASP法檢測血小板反應(yīng)性與CYP2C19基因型的相關(guān)性最高，有研究報道由于VASP法可以檢測P2Y12受體活性，因此該方法與使用氯吡格雷進(jìn)行抗血小板聚集治療的血小板功能檢測具有較高的特異性[20-21]。

此外，AA-LTA主要反映阿司匹林用藥后血小板的反應(yīng)性，但仍不清楚它與CYP2C19基因型存在的相關(guān)關(guān)系，考慮可能有兩個原因：一是樣本量偏少，致使檢測結(jié)果存在一定偏倚；二是在服用阿司匹林的患者中，血小板高反應(yīng)性人群中CYP2C19慢代謝型比例較高，因而出現(xiàn)了統(tǒng)計學(xué)差異。但是否由于患者為CYP2C19慢代謝型而導(dǎo)致阿司匹林用藥后的血小板高反應(yīng)性，目前尚未見相關(guān)報道。筆者將在后續(xù)研究中通過擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步觀察。

目前，常用的血小板功能檢測方法還有Verify Now、血栓彈力圖法(TEG)、多電級凝集法(MEA)等，但無論哪種方法都無法全面地反映血小板功能[16]。 目前臨床上仍無指南明確指出如何選擇血小板功能檢測方法。但考慮到各種檢測方法的局限性，常常同時使用兩種以上血小板功能檢測方法，當(dāng)結(jié)果出現(xiàn)矛盾時還應(yīng)根據(jù)臨床癥狀等全面評估后再決定是否調(diào)整治療方案。本研究結(jié)果顯示，CYP2C19基因EM型及IM型患者通過VASP法檢測的血小板反應(yīng)性存在明顯差異，且這兩種基因型患者的血小板抵抗不嚴(yán)重，因此建議對EM型及IM型患者使用VASP法檢測，而PM型患者在治療中容易出現(xiàn)血小板抵抗，有較高的血栓性疾病風(fēng)險，因此建議參考AALTA與ADP-LTA結(jié)果，并根據(jù)臨床癥狀及時調(diào)整治療方案。

綜上所述，CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷用藥后患者血小板的高反應(yīng)性密切相關(guān)。由于VASP法、AA-LTA法和ADP-LTA法之間的相關(guān)性較低，且單一檢測方法很難全面反映血小板功能，因此進(jìn)行血小板功能檢測仍需使用兩種以上方法相互印證。