丹參酮ⅡA對人肝癌細(xì)胞Huh7增殖與凋亡的影響

趙珍， 李明花

山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619

2012年世界癌癥統(tǒng)計(jì)顯示全球范圍內(nèi)肝癌的新發(fā)病例是78.2萬，死亡病例是74.5萬，其中我國新發(fā)病例和死亡病例均占50%以上[1]。2015年全國癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告中顯示肝癌發(fā)病率和死亡率均居前三[2]，合并所有階段，肝癌5年的生存率不超過17%[3]。所有肝癌病例中，肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生率占70%～90%，肝細(xì)胞癌的主要風(fēng)險(xiǎn)因素包括：乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染，酒精性肝硬化及非酒精性肝病綜合征等[4-6]。盡管肝癌的早期治療手段以及診斷技術(shù)日益提高，但目前療效仍然不容樂觀，生存期短且易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，缺乏根治的方法，因此臨床上急需開發(fā)高效、低毒或可作用于新靶點(diǎn)的藥物。與西藥比較，中藥毒副作用更小，更容易被患者接受，在抗腫瘤治療中起重要作用。

丹參酮ⅡA(TanⅡA)是一種從丹參中分得的脂溶性單體，呈桔紅色針狀結(jié)晶，易溶于二甲基亞砜和乙醇醇等有機(jī)溶劑，微溶于水[7，8]。丹參為唇形科植物丹參的干燥根及根莖，味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效。Chao Lv等[9]通過做細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、雙染流式細(xì)胞術(shù)以及Western blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，丹參酮ⅡA對MCF-7細(xì)胞具有顯著的抑制力，它的機(jī)制可能與抑制凋亡蛋白Bcl-2，和激活Caspase-3有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對丹參酮ⅡA的體外抗肝癌作用進(jìn)行了初步研究，為更好地開發(fā)利用丹參酮ⅡA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物及細(xì)胞

丹參酮ⅡA購買于上海一林生物科技有限公司，高效液相色譜法(HPLC)檢測藥物的純度≥98%，產(chǎn)品CAS號為35825-57-1。丹參酮ⅡA溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，丹參酮ⅡA儲(chǔ)存液濃度為20 mmol·L-1，儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

Huh7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.2 主要試劑與儀器

圖1 丹參酮ⅡA的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of tanshinone IIA

DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胎牛血清(美國Science cell公司)、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素鏈霉素雙抗(美國Gbico公司)、胰酶、胎牛血清(美國Science cell公司)；CCK-8試劑；RIPA裂解液；蛋白定量試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒；蛋白酶抑制劑、p53抗體和tublin抗體購自美國Proteintech公司；Cleaved-PARP和Caspase-9抗體均購自中國碧云天生物技術(shù)公司；山羊抗兔和驢抗小鼠二抗均購自香港IRDye 800CW公司；實(shí)驗(yàn)用到的試劑規(guī)格都為國產(chǎn)分析純。

HF90 CO2培養(yǎng)箱；PowerPac Basic電泳儀、Odyssey FC雙色紅外激光成像系統(tǒng)(香港Gene Company Limited公司)；Leica TCS SP8顯微鏡(德國Leica公司)，Epoch全波長酶標(biāo)儀；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國Becton Diskon公司)；TC10細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將人肝癌Huh7細(xì)胞消化收集，細(xì)胞懸液以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度均勻接種于96孔板中，每孔100 μL培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞12 h貼壁后，實(shí)驗(yàn)分為空白組、對照組以及給藥組，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，對照組加0.1%DMSO，給藥組加入濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L丹參酮IIA。給藥24 h后更換新鮮的培養(yǎng)基，每孔避光加入10 μL CCK-8試劑，振蕩混勻，置于培養(yǎng)箱孵育1.5 h。使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定各孔吸光度光密度(optical density，OD)值，計(jì)算丹參酮IIA對細(xì)胞增殖抑制率，通過GraphPad Prism6.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)

2.2 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

將人肝癌Huh7細(xì)胞消化收集，細(xì)胞懸液以7×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度均勻接種于6孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。待細(xì)胞12 h貼壁后，實(shí)驗(yàn)分為空白組和給藥組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，給藥濃度分別為2.5、5、10、20 μmol/L。培養(yǎng)24小時(shí)后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期

將人肝癌Huh7細(xì)胞消化收集，細(xì)胞懸液以7×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度均勻接種于6孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。待細(xì)胞12 h貼壁后，實(shí)驗(yàn)分為空白組和給藥組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，給藥濃度分別為2.5、5、10、20 μmol/L。培養(yǎng)24小時(shí)后胰酶消化收集各組細(xì)胞懸液，使用PBS洗滌2次，檢測細(xì)胞周期時(shí)，向各組細(xì)胞加入5 μL Annexin V，F(xiàn)ITC結(jié)合物，再加入5 μL PI染色液，最后加入400 μL PBS，在室溫下避光培養(yǎng)15 min，加樣到流式細(xì)胞儀檢測。檢測細(xì)胞周期時(shí)，按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書操作，加樣到流式細(xì)胞儀檢測各階段細(xì)胞的百分率。

2.4 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)

將人肝癌Huh7細(xì)胞消化收集，細(xì)胞懸液以5×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度均勻接種于10 cm培養(yǎng)皿中，每孔8 mL培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。待細(xì)胞12 h貼壁后，實(shí)驗(yàn)分為空白組和給藥組，給藥濃度分別為2.5、5、10、20 μmol/L。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入適量預(yù)冷的PBS，使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，離心(4 000 rpm、4℃、3 min)，重復(fù)以上操作2次，細(xì)胞中加入適量RIPA裂解液，冰上裂解20 min后，離心(13 000 rpm、4℃、15 min)，吸出上清蛋白，切勿吸出碎片。蛋白定量采用BCA法，沸水中煮5 min，取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完成后切膠，轉(zhuǎn)膜70 min，電轉(zhuǎn)在低溫下進(jìn)行，將終止的PVDF膜取出，TBST洗膜3次，取出膜后用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別使用脫脂牛奶稀釋的一抗Caspase-9(1∶1 000)、Cleaved-PARP(1∶1 000)、p53(1∶2 000)和Tublin(1∶5 000)孵育過夜，回收一抗，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗孵育2 h，TBST再次洗膜3次，每次5 min，采用掃膜儀進(jìn)行掃膜，實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果如圖2所示，不同濃度的丹參酮IIA作用于人肝癌Huh7細(xì)胞24 h后，和對照組比較，細(xì)胞增殖抑制率隨著丹參酮IIA濃度的增大而升高，藥物作用24 h的IC50為8.76 μmol/L。

圖2 丹參酮ⅡA對Huh7細(xì)胞增殖的影響(±s，n=3)Figure 2 Effect of tanshinoneⅡA on proliferation of Huh7 cells(±s，n=3)

3.2 丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞形態(tài)的影響

結(jié)果如圖3所示，不同濃度(2.5、5、10、20 μmol/L)丹參酮IIA作用于人肝癌Huh7細(xì)胞24h后，與對照組比較，細(xì)胞數(shù)量隨著丹參酮IIA濃度的增大呈逐漸減少的趨勢。當(dāng)?shù)⑼狪IA濃度達(dá)到10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮現(xiàn)象，呈凋亡的狀態(tài)。

圖3 丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）Figure 3 Effect of tanshinone IIA on morphology of Huh7 cells（100×）

3.3 丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果如圖4所示，不同濃度(2.5、5、10、20 μmol/L)丹參酮IIA處理細(xì)胞24 h，與對照組比較，隨著丹參酮IIA給藥濃度的升高，細(xì)胞凋亡率明顯增加，尤其在20 μmol/L時(shí)，其凋亡率達(dá)到53.46%，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.4 丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞周期的影響

圖4 丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞凋亡的影響(±s，n=3)Figure 4 EEffect of tanshinone IIA on apoptosis of Huh7 cells(±s，n=3)

結(jié)果如圖5所示，不同濃度(2.5、5、10、20 μmol/L)丹參酮IIA作用于人肝癌Huh7細(xì)胞24 h后，和對照組比較，隨著丹參酮IIA給藥濃度的增加，各組細(xì)胞的周期均發(fā)生了顯著變化，G1期細(xì)胞呈濃度依賴性增多，S期細(xì)胞逐漸減少，表明丹參酮IIA具有阻滯細(xì)胞周期的作用，阻滯周期于G1期，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞周期的影響(±s，n=3)Figure 5 Effect of tanshinone IIA on cell cycle of Huh7 cells(±s，n=3)

3.5 丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖6所示，不同濃度(2.5、5、10 μmol/L)丹參酮IIA作用于Huh7細(xì)胞24 h后，以Tublin作為內(nèi)參，與對照組比較，隨著丹參酮IIA濃度的增大，人肝癌Huh7細(xì)胞cleaved-PARP、Caspase-9以及p53蛋白水平表達(dá)逐漸升高，促凋亡效果明顯。各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響(±s，n=3)Figure 6 Effect of tanshinone IIA on protein expression of apoptosis in Huh7 cells(±s，n=3)

4 討論

肝癌為常見的消化道惡性腫瘤，在我國其死亡率在惡性腫瘤中居第二位，且呈逐年上升趨勢[10]。傳統(tǒng)的手術(shù)治療和放化療都有一定局限性，且治療后易復(fù)發(fā)，對機(jī)體的繼發(fā)性損傷也很大，藥物治療仍是肝癌治療的主要手段之一。丹參酮IIA是從唇形科植物丹參中分離得到的主要活性單體之一，近年來許多研究表明丹參酮IIA在體外具有良好的抗腫瘤作用，可顯著抑制前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌和肝癌的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及調(diào)控細(xì)胞周期分布[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥可以通過抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移等達(dá)到控制肝癌細(xì)胞的目的[12-15]。本研究主要對天然化合物丹參酮IIA對影響人肝癌Huh7細(xì)胞的增殖和凋亡作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明Huh7細(xì)胞增殖活力隨著丹參酮IIA濃度的增大而降低；晚期凋亡細(xì)胞比例明顯增多；細(xì)胞周期顯著阻滯在G1期；表明在體外丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞的抗腫瘤作用較強(qiáng)。

多數(shù)情況下，抗腫瘤藥物殺死腫瘤細(xì)胞的方法是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)。如P53、cleaved-PARP以及Caspase-9等基因與腫瘤細(xì)胞凋亡具有密切關(guān)系，它們對于研究腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制具有研究意義；同時(shí)也是重要的靶蛋白[16]和重要的抑癌基因，它們的突變對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，其在肝癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)及轉(zhuǎn)移中同樣發(fā)揮功能。p53是最早發(fā)現(xiàn)的具有抑制腫瘤作用的蛋白之一，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成以及使基因組趨于穩(wěn)定。p53的抗腫瘤作用主要是通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的[17]。Caspase是促使細(xì)胞凋亡的最終途徑。在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，是多條凋亡通路的匯聚點(diǎn)，是執(zhí)行凋亡的最終途徑。此外，Caspase發(fā)揮作用的另一途徑是完成自我活化，該過程是通過相互激活來實(shí)現(xiàn)的，Caspase9是最重要的凋亡始動(dòng)子之一，它位于級聯(lián)反應(yīng)上游，一旦出現(xiàn)級聯(lián)放大效應(yīng)[18]，在其他蛋白參與下，Caspase9會(huì)發(fā)生自我激化。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA可以提高促凋亡蛋白cleaved-PARP、Caspase-9以及p53的表達(dá)水平，具有顯著的誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA對Huh7細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用，這個(gè)凋亡過程是caspases及p53參與的，具有很好的抗肝癌活性，這為研究丹參酮IIA抗腫瘤作用提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。