南方紅豆杉水煎液HPLC特征圖譜方法的初步建立

馮小權(quán)， 廖嫻， 黃月純， 陳堅(jiān)雄， 黃可兒， 利創(chuàng)華

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州市醫(yī)藥職業(yè)學(xué)校，廣東 廣州 510430

紅豆杉是世界上公認(rèn)的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物。我國(guó)紅豆杉有4種及1個(gè)變種，南方紅豆杉(T.chinensisi，Rehd.var.mairei)是我國(guó)分布最為廣泛的紅豆杉屬植物變種[1]。從紅豆杉樹(shù)皮和嫩葉中提取的紫杉醇，是天然抗癌藥，但其臨床療效及紫杉醇在水環(huán)境中的降解動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果，水提取物中主要有效成分并非微克級(jí)含量的紫杉醇[2]。水煎劑是中藥應(yīng)用的傳統(tǒng)方式及臨床應(yīng)用的主要形式，南方紅豆杉具有一定的抗腫瘤作用，其水煎劑已在臨床廣泛應(yīng)用，且安全有效[3-7]。

目前對(duì)南方紅豆杉的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、繁殖技術(shù)等方面，而關(guān)于南方紅豆杉水煎液特征圖譜的研究報(bào)道較少。高效液相色譜法(HPLC)是目前廣泛應(yīng)用于藥物分析和質(zhì)量控制領(lǐng)域的色譜技術(shù)。為了較全面反映南方紅豆杉水煎液質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，本文采用HPLC特征圖譜分析技術(shù)建立南方紅豆杉水煎液特征圖譜，為進(jìn)一步采購(gòu)不同批次的南方紅豆杉時(shí)作質(zhì)量判斷和把關(guān)，為下一步建立南方紅豆杉水煎液在大鼠血清中UPLC特征圖譜的分析方法提供方法學(xué)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HP1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)。

1.2 材料

紫杉醇對(duì)照品(批號(hào)：111276)購(gòu)自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，面積歸一法液相色譜結(jié)果≥98%；甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司)；水為屈臣氏蒸餾水；其他試劑均為分析純。南方紅豆杉中藥飲片購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)梁文能副主任中藥師鑒定為南方紅豆杉(Taxus.Chinensis.Var.Mairei)紅豆杉科紅豆杉屬植物紫杉人工栽培品的干燥枝葉。南方紅豆杉由康美藥業(yè)股份有限公司提供，產(chǎn)地均為浙江，4個(gè)批號(hào)分別：180350491、181150561、190250181、190550401。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱ZORBAX SB-Aq(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～20 min，3%～10%A；20～50 min，10%～25%)；流速：1 ml·min-1，柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm，進(jìn)樣量：2μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取紫杉醇對(duì)照品3.8 mg，精密稱取，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，精密吸取1 ml置25 ml容量瓶，加甲醇定容至刻度，配制成濃度為3.04 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取10 g南方紅豆杉置于不銹鋼鍋，加15倍水浸泡30 min，煮沸30 min，倒出藥液，后加10倍水煮沸20 min，再8倍水煮沸20 min，合并3次藥液過(guò)濾，置電磁爐上濃縮至成約藥液5 ml，得2 g·ml-1(生藥量)紅豆杉水煎液[2]。精密吸取水煎液4 ml，加甲醇6 ml，放置2 h，超聲處理20 min，取出，放冷，離心，取上清液至10 ml量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批南方紅豆杉藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取2 μl進(jìn)行高效液相色譜儀測(cè)定分析，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好，方法學(xué)考察可行。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液2 ml，分別在0、2、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明供試品溶液24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 樣品測(cè)定

取不同批次的南方紅豆杉樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，圖1，圖2。

表1 4批南方紅豆杉水煎液HPLC特征圖譜測(cè)定結(jié)果Table 1 Test results of HPLC characteristic spectrum for 4 batches aqueous extract of Taxus chinensis var.Mairei

圖1 4批南方紅豆杉水煎液HPLC特征圖譜重疊圖Figure 1 HPLC characteristic spectrum overlapping for 4 batches aqueous extract of Taxus chinensis var.Mairei

圖2 4批南方紅豆杉水煎液HPLC特征圖譜共有模式圖Figure 2 Common pattern of HPLC characteristic spectrum for 4 batches aqueous extract of Taxus chinensis var.Mairei

3 討論

根據(jù)特征峰紫外光譜特點(diǎn)，本試驗(yàn)考察了不同柱溫(25℃、30℃、35℃)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果以25℃時(shí)效果最優(yōu)。篩選不同流速(0.8、1.0、1.2 ml·min-1)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果以為1 ml·min-1效果最優(yōu)。篩選不同流動(dòng)相(乙腈-水、甲醇-水)梯度洗脫方法對(duì)分離效果的影響，結(jié)果差異不明顯?？疾炝瞬煌瑱z測(cè)波長(zhǎng)(227、228、232、254、300、310 nm)分離效果，在227 nm條件下，紫杉醇對(duì)照品有最大吸收，干擾較少，基線較平穩(wěn)，但其他特征峰基本無(wú)吸收或吸收較小。根據(jù)對(duì)特征峰紫外光譜分析，較多特征峰在310 nm波長(zhǎng)有大吸收，特征峰較豐富，特征圖譜相似度較高，故本文選用310 nm作為南方紅豆杉水煎液HPLCT特征譜檢測(cè)波長(zhǎng)。經(jīng)方法學(xué)考察，本試驗(yàn)所建立的色譜條件方法可行，符合中藥色譜指紋圖譜建立的技術(shù)要求，可用于南方紅豆杉水煎液HPLC特征圖譜檢測(cè)。

紫杉醇是從紅豆杉樹(shù)皮提取分離的天然次生代謝產(chǎn)物，對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)起到抑制作用，是具有抗癌效應(yīng)的中藥材[8]，是南方紅豆杉中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)成分之一，本文探討波長(zhǎng)227 nm檢測(cè)方法可作為南方紅豆杉品種的快速鑒別方法提供參考。前期實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)紫杉醇對(duì)照品在227 nm左右不吸收。經(jīng)查文獻(xiàn)，有報(bào)道儲(chǔ)存對(duì)照品溶液的聚乙烯等塑料EP管對(duì)紫杉醇的穩(wěn)定性及其不利，推測(cè)紫杉醇很可能在塑料管壁上發(fā)生吸附作用[9]，因而可檢測(cè)的自由分子濃度過(guò)低導(dǎo)致在波長(zhǎng)227 nm無(wú)法檢測(cè)特征峰。紫杉醇的吸附作用涉及紫杉醇的生物和化學(xué)反應(yīng)行為，值得在今后的研究中深入探討。

由于收集較多批次南方紅豆杉樣品存在一定困難，本文只初步建立了南方紅豆杉水煎HPLC液特征圖譜檢測(cè)方法，特征峰成分分析有待后續(xù)收集更多批次樣品進(jìn)一步完善研究，且以期找尋相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)特征峰成分鑒定，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中擬采用質(zhì)譜分析方法，對(duì)此類結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。