蜈蚣中藥配伍減輕蜈蚣所致肝腎損傷的作用機(jī)制研究

田莎， 姚天振， 寧迪敏， 黃曉蒂， 鄭敏楠， 龍琰， 田雪飛

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208

《素問(wèn)》言：“大積大聚。其可犯也，衰其大半而止，過(guò)則死”。故大積大聚者，非峻猛之藥不可攻不可散，此類藥物常具毒性，這種毒性功效是雙刃劍，惡性腫瘤非此類藥物不能衰，但稍有不慎則會(huì)正氣受損，肝腎功能損傷是安全性關(guān)鍵，而且是易受病人關(guān)注的敏感指標(biāo)。研究組前期發(fā)現(xiàn)蜈蚣具有較好的抗肝癌活性[1]，然而，自古以來(lái)，蜈蚣一直被認(rèn)為是有毒之蟲(chóng)，大凡收載蜈蚣的中藥書(shū)籍均記載蜈蚣有毒，藥典和教科書(shū)皆謂蜈蚣性辛溫，有毒，《神農(nóng)本草經(jīng)》將蜈蚣列為下品。現(xiàn)代臨床研究、藥理研究表明蜈蚣具有肝腎毒性[2-7]。據(jù)此，甄選護(hù)肝中藥“靈芝”、扶正中藥“人參”、去莝中藥“大黃”配伍蜈蚣，對(duì)比其對(duì)蜈蚣所致肝腎損傷的修復(fù)作用，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料、試藥與儀器

1.1 藥物蜈蚣(批號(hào)：201700854)、人參(批號(hào)：2017020170)、靈芝(批號(hào)：2016090107)、大黃(批號(hào)：2016016470)購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，蜈蚣經(jīng)鑒定為少棘巨蜈蚣。

1.1.1 蜈蚣提取液的制備 蜈蚣干燥全蟲(chóng)，粉碎；加入10倍蒸餾水，浸泡30 min后煎煮提取1h左右，過(guò)濾，收集濾液；再次加8倍的蒸餾水，煎煮提取1 h左右，過(guò)濾，收集濾液；合并兩次煎煮的濾液，并過(guò)濾一次，將濾液隔水蒸至相當(dāng)于0.6 g生藥/mL原液。以0.6 g生藥/mL原液，80℃水浴30 min，連續(xù)3d間歇滅菌后，1 000 rmp離心10 min，-4℃保存。

1.1.2 靈芝、人參、大黃水提液制備 分別取靈芝、人參、熟大黃加入10倍蒸餾水浸泡30 min，武火煮沸后用文火煎煮30 min，過(guò)濾，收集濾液。再加蒸餾水8倍，煎煮提取30 min左右，合并兩次濾液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成濃度至相當(dāng)于0.1 g生藥材/ml。以0.1 g生藥材/ml的原液，80℃水浴30 min，連續(xù)3 d間歇滅菌后，1 000 rmp離心10 min，-4℃保存。

1.2 動(dòng)物SD大鼠60只，體重180～220 g、雄性。購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(湘)2016-0002，飼養(yǎng)于中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室屏障系統(tǒng)內(nèi)，濕度：46%～51%，溫度：26～28℃，SPF級(jí)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑大鼠MDA ELISA檢測(cè)試劑盒(北京綠源伯德生物科技有限公司)。

1.4 儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)(SW-CJ-ICV，蘇凈安泰公司，中國(guó))；自動(dòng)酶標(biāo)儀(TECAN，奧地利)；臺(tái)式離心機(jī)(TDZ5-40，長(zhǎng)沙天創(chuàng)儀器公司，中國(guó))；高壓蒸汽消毒器(ZDX-35B，上海申安器械廠，中國(guó))；超聲波清洗機(jī)(杭州大和熱磁力電子公司，中國(guó))；DF-10A搖擺式中藥粉碎機(jī)(溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司，中國(guó))。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、蜈蚣組、蜈蚣+靈芝組、蜈蚣+人參組、蜈蚣+大黃組，每組12只。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)[5，8]，同時(shí)參照《藥理試驗(yàn)方法學(xué)》中人與動(dòng)物體表面積折算的比值表計(jì)算，除正常組外，每組均灌胃蜈蚣水煎液4.5 g生藥量/kg(相當(dāng)于臨床劑量的10倍)，其他組在此基礎(chǔ)上再分別灌胃靈芝(1.08 g生藥/kg)、人參(0.8 g生藥/kg)、大黃(0.45 g生藥/kg)(相當(dāng)于臨床劑量)，劑量根據(jù)人的臨床劑量換算而成。正常對(duì)照組每日灌胃等體積蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，給藥量為3 mL/d/只，每日1次，連續(xù)14 d。

2.2 肝腎功能檢測(cè)各組大鼠連續(xù)用藥14 d后，禁食16 h，麻醉，腹主動(dòng)脈取血，血液于室溫下靜置1 h，待凝固后，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清4℃凍存?zhèn)錂z。OLYMPUS AU640全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2.3 肝臟組織脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)測(cè)定制備10%肝組織勻漿，離心取上清液100μL，按照大鼠MDA ELISA試劑盒步驟，檢測(cè)MDA含量。

2.4 病理學(xué)檢查肝臟組織切片經(jīng)HE染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞損傷程度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間多重比較如方差齊采用LSD檢驗(yàn)，如方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體重及一般情況蜈蚣+大黃組部分大鼠在用藥第3天開(kāi)始出現(xiàn)排稀便，程度較輕，持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，其余各組大鼠排褐色軟便。在實(shí)驗(yàn)期間，未觀察到動(dòng)物豎毛、驚厥、抽搐、小便失禁等嚴(yán)重的中毒反應(yīng)，大鼠無(wú)一死亡。各給藥組及正常對(duì)照組在14d給藥期內(nèi)精神良好，行為活潑，毛色光澤，進(jìn)水及攝食正常。各組間比較，體重?zé)o明顯差異(P＞0.05)(表1)。

3.2 對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響組間多重比較結(jié)果顯示，蜈蚣組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)高于正常組(P＜0.05)；蜈蚣+靈芝組、蜈蚣+人參組、蜈蚣+大黃組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)低于蜈蚣組(P＜0.05)(表1)，即靈芝、人參、大黃能降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，改善蜈蚣所致肝損傷。

3.3 對(duì)血肌酐的影響組間多重比較結(jié)果顯示，蜈蚣組血肌酐(SCr)高于正常組(P＜0.05)；蜈蚣+靈芝組、蜈蚣+人參組、蜈蚣+大黃組的血肌酐低于蜈蚣組(P＜0.05)(表1)，即靈芝、人參、大黃能降低血肌酐，改善蜈蚣所致腎損傷。

表1 各組體重、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血肌酐、丙二醛比較(±s)Table 1 Comparison of weight；ALT；SCr and MDA in each group(±s)

表1 各組體重、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血肌酐、丙二醛比較(±s)Table 1 Comparison of weight；ALT；SCr and MDA in each group(±s)

注：與正常組比較：①P<0.05；與蜈蚣組比較：②P<0.05。

組別正常組蜈蚣組蜈蚣+靈芝組蜈蚣+人參組蜈蚣+大黃組MDA(nmol/mL)50.98±6.66 81.14.± 13.36①59.69±12.06②52.89±4.02②65.22±12.74②n 12 12 12 12 12體重(g)303.3±25.2 294.6±34.0 301.3±26.4 298.6±33.3 280.6±39.0 ALT(U/L)34.07±2.15 40.13±1.30①33.85±1.05②35.88±3.25②35.28±3.50②SCr(mmol/L)19.60±0.60 25.00±2.00①19.50±5.50②21.00±2.85②19.00±2.54②

3.4 對(duì)肝組織MDA含量的影響組間多重比較結(jié)果顯示，蜈蚣組MDA高于正常組(P＜0.01)；蜈蚣+靈芝組、蜈蚣+人參組、蜈蚣+大黃組的MDA含量低于蜈蚣組(P＜0.01)，見(jiàn)表1，提示靈芝、人參、大黃具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。

3.5 對(duì)肝組織病理變化的影響與正常組比較，蜈蚣組大鼠肝組織損傷嚴(yán)重，可見(jiàn)的肝細(xì)胞腫脹，呈氣球樣變，胞質(zhì)疏松，部分細(xì)胞核溶解、壞死；并有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。蜈蚣+靈芝組上述癥狀明顯減輕，與蜈蚣+人參組、蜈蚣+大黃組相近(圖1)，提示靈芝、人參、大黃對(duì)大鼠肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

圖1 各組肝組織HE染色（×150倍）Figure 1 Liver tissues from each group were excised and prepared for HE staining（×150）

4 討論

蜈蚣具有一定的抗腫瘤活性，被廣泛運(yùn)用于各種腫瘤的治療。臨床治療惡性腫瘤時(shí)，蜈蚣用量較大，且用藥時(shí)間長(zhǎng)，而蜈蚣作為有毒中藥，具有肝腎損傷的風(fēng)險(xiǎn)。蜈蚣劑量過(guò)大可引起中毒，其中毒潛伏期約30分鐘至4小時(shí)。中毒患者的主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、全身無(wú)力、不省人事、心跳及脈搏緩慢、呼吸困難、體溫及血壓下降[9]。若出現(xiàn)溶血反應(yīng)，可伴有醬油色尿，黑便，溶血性貧血癥狀。大劑量服用蜈蚣粉后可致肝功能損害(5條/日，服用2天)[6]及急性腎功能衰竭死亡(2條/日，服用3天)[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)相同劑量蜈蚣作用于肝癌荷瘤小鼠和正常小鼠，其肝毒性存在差異。為取得類似的肝毒性，本研究各組蜈蚣的用量選用臨床劑量的10倍[[11]，結(jié)果表明，大劑量的蜈蚣提取液具有肝腎毒性。

肝癌治療中，蜈蚣常與養(yǎng)肝、扶正等藥物配伍。本研究甄選靈芝、人參、大黃配伍蜈蚣，觀察其對(duì)蜈蚣肝腎損傷的拮抗作用。有“護(hù)肝仙草”之稱的靈芝能補(bǔ)五臟之氣，減少不良反應(yīng)中藥毒所致。近年大量關(guān)于靈芝的藥理研究證明，靈芝及其有效成分具有獨(dú)特的保護(hù)肝臟，減輕肝損傷的作用，可明顯減低因藥物引起的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶的含量、降低肝臟甘油三酯含量、增加對(duì)肝炎病毒的耐受性等作用[12，13]。本研究發(fā)現(xiàn)其具有拮抗蜈蚣所致肝腎損傷作用。人參具有大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)脾益肺的作用，有研究表明其具有抗炎、抗過(guò)敏、抗休克、抗腫瘤等活性，同時(shí)人參及人參皂苷對(duì)酒精性肝損傷[14]、梗阻性黃疸大黃肝損傷、藥物性肝損傷[15，16]、免疫性肝損傷[17]等均有修復(fù)作用。本研究結(jié)果表明，人參對(duì)蜈蚣所致肝腎損傷具有一定修復(fù)作用。

大黃作為具有代表性的攻下藥物，具有攻下積滯、利膽退黃等功效。研究表明，大黃可通過(guò)改善內(nèi)毒素血癥等途徑逆轉(zhuǎn)肝損傷[18]。李杲曰：“大黃能推陳致新，如戡定禍亂，以致太平”，具有利膽、瀉下、利小便之功效，具有利二便將藥毒排除的可能，且有研究發(fā)現(xiàn)其具有肝腎保護(hù)作用[19-22]，被應(yīng)用于藥物性肝腎損傷治療。本研究結(jié)果表明，大黃同靈芝、人參一樣，具有肝腎保護(hù)作用。據(jù)此推測(cè)，下法可能是一種“去莝除毒”的積極療法。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物，可嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹與壞死，其含量可反映組織過(guò)氧化損傷的程度。機(jī)體組織MDA含量的增加或減少間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道，肝損傷發(fā)生時(shí)，肝臟MDA含量亦同時(shí)升高[23，24]，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)大劑量的蜈蚣可使小鼠血清ALT活性明顯上升，同時(shí)肝組織MDA含量明顯增加，靈芝、人參、大黃均可顯著降低小鼠血清ALT活性和肝組織MDA含量，提示靈芝、人參、大黃具有明顯的抗肝損傷作用，其作用機(jī)制可能與抗脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。本研究探索靈芝、人參、大黃等中藥配伍對(duì)大劑量蜈蚣所致藥物性肝腎損傷的修復(fù)作用，以期為臨床合理譴方用藥提供參考。