燈臺葉堿調(diào)節(jié)放射性肺炎細胞及大鼠血清細胞因子水平的實驗研究

劉珊， 蔣永新， 王洋， 張靖熙， 劉馨元， 唐琴，王思毓， 夏玉海， 劉艷艷， 沈紅梅

昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，云南 昆明 650118

放射性肺損傷(Radiation-induced lung injury，RILI)是胸部惡性腫瘤(肺癌、食管癌、乳腺癌、縱膈內(nèi)惡性腫瘤)在接受放射性治療過程中正常肺組織不可避免的受到一定劑量的射線照射而造成的肺損傷[1]。放射性肺損傷作為臨床上常見的放療并發(fā)癥，影響著腫瘤靶區(qū)劑量以及全局放療的療效，是放療療效最大程度發(fā)揮的主要制約因素。據(jù)國內(nèi)外學(xué)者報道，放射性肺炎發(fā)生率約為29.6%～50.3%[2-4]。臨床上主要是通過調(diào)整放療方案、放療總劑量以及放療單次劑量等來預(yù)防、減少放射性肺炎的發(fā)生；并應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、抗生素加強抗感染、輔助以非甾體藥物以及運用中醫(yī)中藥來治療已產(chǎn)生的放射性肺炎。然而，現(xiàn)有的治療方法只能暫時性緩解癥狀，遠期療效欠佳[5]，亟需尋求安全性好、療效佳的治療方案。燈臺葉為云南特色天然民族藥，其粗提物制劑“燈臺葉顆粒”和“燈臺葉片”已上市使用多年，其安全性和有效性均得到臨床驗證，在臨床上主要用于慢性支氣管炎、百日咳等呼吸系統(tǒng)疾病的治療。本研究建立放射性肺炎細胞及大鼠動物模型，探索燈臺葉堿對放射性肺炎的治療療效及其機制。

1 材料及方法

1.1 材料

BEAS-2B支氣管肺泡上皮細胞，購自中科院昆明生物所細胞庫；雄性SD大鼠150只，SPF級，鼠齡6 w，質(zhì)量(300±10)g，由湖南斯萊克景達實驗動物實驗有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0004；胎牛血清、RPMI-1640、PBS、青霉素和鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶、流式細胞術(shù)檢測試劑盒購自Hyclone公司；燈臺葉堿，由中科院昆明植物所提供；流式細胞儀由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 放射性肺炎細胞模型的建立及血清樣本的采集

將BEAS-2B細胞培養(yǎng)于6孔板，待細胞80%融合時根據(jù)前期預(yù)實驗基礎(chǔ)選擇4Gy 6Mv X-ray照射，照射24小時后換液，加入含有燈臺葉堿(C=90 μg/mL)的完全培養(yǎng)基。待燈臺葉堿作用24小時后吸取細胞液上清，4℃低溫離心機中離心1 000 g 5min，取上清液體；立即分裝，并將樣本置于-80℃中保存，待后續(xù)實驗使用。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞因子

將標準品凍干微球用4mL稀釋液稀釋，將最高濃度標準品倍比稀釋；制備捕獲微球；制備檢測抗體；混勻Mixed Capture Beads；分別在各樣品管和標準品管中加入50 μL的Mixed Capture Beads；分別在各樣品管和標準品管中加入50 μL的標準品或樣品：混勻，室溫避光孵育1 h；向各管中加入 50 μL Mixed PE Detection Reagent；混勻室溫孵育1 h：向各管中加入1μL Wash buffer，300 g離心5min；小心棄上清；各管加入300 μL Wash buffer重懸微球；上機分析，檢測細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α的水平。

1.2.3 放射性動物模型的建立及分組

采用隨機數(shù)字法將150只雄性SD大鼠隨機分為6組，每組25只，根據(jù)前期實驗基礎(chǔ)照射劑量選擇16Gy 6Mv X-ray照射大鼠全肺。

分組方式如下：(1)陰性對照組：不予放療，給予生理鹽水10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(2)單純放療組：放療同時給予生理鹽水10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(3)陽性對照組：放療同時給予地塞米松注射液2 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(4)燈臺葉堿低劑量組：放療同時給予燈臺葉堿10 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(5)燈臺葉堿中劑量組：放療同時給予燈臺葉堿20 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(6)燈臺葉堿高劑量組：放療同時給予燈臺葉堿40 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周。

1.2.4 大鼠血清樣本的采集及保存

在放射治療后第10天、第13天、第18天和第21天分別從各組選取5只SD大鼠進行下腔靜脈取血，血清管收集，將全血樣品室溫靜置2小時，于4℃低溫離心機中離心1 000 g 15 min，取上清，將樣本分裝至-80℃中長期保存。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測大鼠血清中細胞因子

設(shè)置標準品孔和待測樣本孔，100 μL標準品溶液或待測樣本溶液加入至每孔，輕晃，混勻，表面貼上板貼，避免溫育將液體過度蒸發(fā)，37℃溫箱溫育2 h。棄去液體，甩干，1 00 μL生物素標記抗體工作液加入至每孔，表面重新貼上新板貼，37℃溫育1 h。棄去孔中的液體，干燥并洗滌板3次，每次浸泡2分鐘，200 μL/孔，甩干。100 μL HRP標記親和素工作液加入至每孔，表面重新貼上新板貼，37℃溫育1 h。棄去孔中的液體，干燥并洗滌板5次。每次浸泡2分鐘，200 μl/孔，甩干。依次加，90 μL底物溶液至每孔中，37℃溫箱避光顯色15～30 min。依次每孔加50 μL終止溶液，使反應(yīng)終止。在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)，在酶標儀上依次測量各孔450 nm波長處的吸光度(OD450)，檢測細胞因子IL-2、IL-4、IL-6的水平。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測大鼠血清中炎癥介質(zhì)

方法同1.2.2，檢測細胞因子TNF-α的水平。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈臺葉堿作用后，BEAS-2B細胞株細胞因子的變化

炎癥介質(zhì)分為促炎因子(IL-2、IL-6、TNF-α)與抗炎因子(IL-4、IL-6、IL-10)。細胞經(jīng)4Gy放射治療后，經(jīng)濃度為90 μg/mL的燈臺葉堿處理24 h后，促炎因子IL-2、TNF-α的細胞上清水平降低(P＜0.05)，抗炎因子IL-4和IL-10的細胞上清水平降低(P＜0.05)。同時作為抗炎和促炎因子的IL-6，其細胞上清水平在燈臺葉堿干預(yù)后未見明顯變化(見表1，圖1)。

表1 燈臺葉堿作用后BEAS-2B細胞株細胞因子的變化(±s)Table 1 Cytokine changes of BEAS-2B cell line after alstonia-leaf alkaloids treatmen(t±s)

表1 燈臺葉堿作用后BEAS-2B細胞株細胞因子的變化(±s)Table 1 Cytokine changes of BEAS-2B cell line after alstonia-leaf alkaloids treatmen(t±s)

*：P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

細胞因子IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-α P值0.0027*0.0063*0.6494 0.0074*0.0407*燈臺葉堿作用前(pg/ml)8.720±0.2417 10.60±0.2714 11.96±0.1808 2.590±0.2483 8.243±0.2050燈臺葉堿作用后(pg/ml)6.383±0.2571 8.863±0.1915 12.23±0.5197 1.263±0.8969 6.647±0.4948

圖1 燈臺葉堿作用后BEAS-2B細胞株細胞因子的變化Figure 1 Cytokine changes of BEAS-2B cell line after alstonia-leaf alkaloids treatment

2.2 燈臺葉堿作用后大鼠血清中細胞因子的變化

2.2.1 IL-2的變化

放療后地塞米松陽性對照組的IL-2的血清水平自放療后10日起維持低水平的狀態(tài)；放療后10日起，IL-2作為促炎因子，單純放療組其血清水平在短暫升高后呈持續(xù)下降趨勢，總體水平接近燈臺葉堿治療組，而高于陽性對照組及陰性對照組；低劑量組高于中劑量組，高劑量組介于二者之間(見圖2)。

2.2.2 IL-4的變化

IL-4是抗炎炎癥介質(zhì)，自放療后經(jīng)燈臺葉堿處理的第10日IL-4血清水平呈現(xiàn)出上升趨勢，但上升程度無顯著燈臺葉堿劑量依賴性，陽性對照組、陰性對照組和放療組自第10日起血清水平始終維持低水平狀態(tài)(見圖3)。

圖2 大鼠血清中細胞因子IL-2的變化Figure 2 Changes of cytokine IL-2 in rats serum

圖3 大鼠血清中細胞因子IL-4的變化Figure 3 Changes of cytokine IL-4 in rats serum

2.2.3 IL-6的變化

IL-6具有抗炎和促炎的雙重作用，燈臺葉堿作用下低劑量組和中低劑量組的IL-6血清水平逐漸下降，高劑量組IL-6的血清水平逐漸升高。陽性對照組和陰性對照組自第10日起血清水平始終維持低水平的波動狀態(tài)，單純放療組始終維持高水平的波動狀態(tài)(見圖4)。

2.3 TNF-α的變化

圖4 大鼠血清中細胞因子IL-6的變化Figure 4 Changes of cytokine IL-6 in rats serum

肺組織遭受電離輻射的損傷后，TNF-α的血清水平升高，隨著燈臺葉堿的作用，TNF-α血清含量逐漸下降，但TNF-α的下降程度無明顯的燈臺葉堿劑量依賴性；單純放療組TNF-α的血清水平始終處于高水平的波動狀態(tài)；陽性對照組及陰性對照組TNF-α的血清水平在放療后第10天已處于低水平的狀態(tài)(見圖5)。

圖5 大鼠血清中細胞因子TNF-α的變化Figure 5 Changes of cytokine TNF-α in rats serum

3 討論

放射治療是肺癌、乳腺癌、食道癌等胸部腫瘤患者的主要治療手段。肺是輻射中度敏感器官，放射治療可使腫瘤附近的肺組織因受到放射劑量超過其生物效應(yīng)的閾值而產(chǎn)生不同程度的損傷。一旦發(fā)生嚴重的放射性肺損傷，必將終止放射治療，轉(zhuǎn)而以大劑量口服糖皮質(zhì)激素控制炎癥為主。然而，糖皮質(zhì)激素帶來的副作用不容忽視，可能耽誤胸部腫瘤治療的最佳時機，加大腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，威脅患者生命[6，7]。因此，現(xiàn)有的治療放射性肺炎的方法僅能暫時緩解臨床癥狀，可導(dǎo)致全身多器官和系統(tǒng)的損傷，實際并未改善患者生活質(zhì)量。臨床迫切需要尋求一種安全有效的治療。在臨床及實驗研究中，中藥預(yù)防和治療放射性肺炎受到越來越多的重視。

燈臺葉多產(chǎn)于云南、廣東等地，生于海拔650 m以下丘陵山地疏林中，為云南及兩廣等地少數(shù)民族用藥，性涼、味苦，能止咳祛痰、退熱消炎，屬被子植物門、夾竹桃科。曾收載于地方藥志，如《陸川本草》、《云南中草藥選》中，并為《云南省藥品標準》(1974)和《中國藥典》(1977年版一部)所收載。傳統(tǒng)中藥燈臺葉堿獲取容易，價格低廉，是從燈臺葉中提取分離的有效成分，具有止咳平喘、清熱解毒的功效，用于急性氣管-支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作期(風(fēng)熱襲肺證)。燈臺葉對放射性肺炎是否有治療作用目前尚未見報道。

有研究發(fā)現(xiàn)放射性肺炎患者肺泡灌洗液中TNF-α分泌增加，但這種反應(yīng)在4個月內(nèi)達到平臺期，這表明，TNF可能在放射性肺炎的早期階段發(fā)揮作用[8]。本研究中TNF-α的變化與文獻報道一致，放療后血清中TNF-α水平上升，經(jīng)燈臺葉堿作用后下降，我們猜測燈臺葉堿可能在早期通過阻斷TNF與TNF受體的結(jié)合，從而阻斷下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時認為早期放射性肺疾病的血清TNF敏感性高，TNF能夠促進炎癥的進展。

白細胞介素(ILs)衍生自肺巨噬細胞以及多種非巨噬細胞來源(例如，肺泡上皮細胞、成纖維細胞和肥大細胞等)。TNF-α和IL-2(早期炎癥反應(yīng)的細胞因子)的研究確立了這些介質(zhì)在肺血管粘附分子上調(diào)中的首要地位。IL-8細胞因子家族作用于白細胞上具有趨化和血管生成活性，能夠誘導(dǎo)膠原合成和細胞增殖[9]。本研究顯示：SD大鼠照射后血清IL-2、IL-6、TNF-α含量短期內(nèi)立即升高，提示IL-2、IL-6和TNF-α均作為抗炎介質(zhì)在放射性肺炎的早期發(fā)揮作用；燈臺葉堿干預(yù)后SD大鼠IL-2和IL-6的血清水平與TNF-α變化趨勢相同，呈下降趨勢，說明燈臺葉堿對照射后SD大鼠IL-2和IL-6有一定抑制作用，在第4周血清IL-2和IL-6含量與地塞米松組持平，可見，燈臺葉堿能有效減輕炎性反應(yīng)；SD大鼠血清中的抗炎因子IL-4在燈臺葉堿干預(yù)后呈現(xiàn)上升的趨勢，表明燈臺葉堿能增強大鼠的免疫系統(tǒng)功能，刺激大鼠免疫系統(tǒng)自我調(diào)節(jié)以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，這種效應(yīng)在第4周時IL-4血清含量達到最高，高于地塞米松組血清IL-4水平，說明燈臺葉堿可能較地塞米松的抗炎效應(yīng)更佳。我們猜測其治療機制與文獻報道類似，為單萜吲哚類生物堿促進支氣管平滑肌高爾基體鈣庫外流，激活PLC-IP3/DAGPKC信號通路而起到鎮(zhèn)咳作用[10]；同時可能通過增強組織內(nèi)谷胱甘肽(GSH)過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，降低過氧化水平，達到抗炎鎮(zhèn)痛的效果[11]。IL-2、TNF-α在細胞及動物實驗中趨勢相反，原因考慮為：①細胞和動物試驗中檢測細胞因子時樣本經(jīng)過放射治療后的時間并不相同，放療有延遲效應(yīng)，可能導(dǎo)致結(jié)果的差異；②細胞和動物樣本在很多方面存在差異，可能導(dǎo)致最終細胞因子結(jié)果有一定差異。具體原因尚待進一步研究。

本研究通過對燈臺葉堿的治療機制研究，發(fā)現(xiàn)燈臺葉堿可成為促炎因子的阻斷劑，有望成為臨床防治放射性肺炎的有效藥物。