基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析柴胡疏肝散治療乳腺癌的作用機(jī)制

董阿茹汗， 思志強(qiáng)， 張瑩

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193

乳腺癌屬于中醫(yī)“乳巖”“乳石癰”“奶巖”范疇，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制，朱丹溪《格致余論》中提到：“肝氣橫逆，遂成隱核”。宋代陳自明《婦人大全良方》：“乳巖由于憂思郁結(jié)，所愿不遂，肝脾氣逆，以致經(jīng)絡(luò)閉塞，結(jié)積成核”。提示乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與情志不暢、肝氣郁結(jié)密切相關(guān)。柴胡疏肝散出自葉文齡《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》，為疏肝理氣代表方，具有疏肝解郁、理氣化瘀之效。在臨床中，柴胡疏肝散多用于治療肝郁氣滯型乳腺癌，并作為乳腺癌中醫(yī)治療的基礎(chǔ)方得到廣泛應(yīng)用[1，2]，但其作用機(jī)制尚不明確。本文根據(jù)中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的特性，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，對(duì)柴胡疏肝散治療乳腺癌作用機(jī)制進(jìn)行分析，為臨床應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供研究思路和方向。

1 研究方法

1.1 柴胡疏肝散活性成分搜集通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，檢索柴胡疏肝散中藥物柴胡、香附、川芎、陳皮、枳殼、白芍、甘草化學(xué)活性成分?jǐn)?shù)據(jù)，由于中藥進(jìn)入體內(nèi)后多通過(guò)有效成分入血發(fā)揮作用，故根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)口服生物利用度OB≥30%，藥物相似性DL≥0.18對(duì)成分信息進(jìn)行篩選，篩選出有效活性成分。

1.2 有效活性成分靶點(diǎn)整理使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)及VBA工具收集成分靶點(diǎn)信息，并通過(guò)UniProt Knowledgebase數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選及名稱規(guī)范。利用Cytoscape 3.2.1軟件Network Analysis功能對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治鲆院Y選出核心靶點(diǎn)，篩選出Degree≥10的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。

1.3 乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)收集通過(guò)疾病名稱搜索TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//db.idrblab.org/ttd/)、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genecards.org/)獲取乳腺癌相關(guān)基因及靶點(diǎn)，整理為疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 構(gòu)建蛋白相互作用圖通過(guò)Venny 2.1.0工具畫出篩選后藥物成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)韋恩圖，獲取二者共同作用靶點(diǎn)。將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)，將物種限定為人，獲得蛋白相互作用信息并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)degree值及相互作用關(guān)系設(shè)置節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及邊的粗細(xì)及顏色。

1.5 功能富集分析(Gene Ontology，GO)及通路分析基于 DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/)，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋，包括生物過(guò)程(Biological Process，BP)、細(xì)胞組成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)以了解靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過(guò)程，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析以預(yù)測(cè)靶點(diǎn)可能參與的信號(hào)通路，將所獲得的數(shù)據(jù)信息借助R 3.6.1軟件及R Studio軟件繪制氣泡圖。

1.6 化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖使用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建柴胡疏肝散活性成分-靶點(diǎn)-乳腺癌PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 柴胡疏肝散活性成分與靶點(diǎn)收集

通過(guò)搜集TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)并經(jīng)過(guò)篩選，共得到符合OB≥30%，DL≥0.18條件的化學(xué)成分157個(gè)(見(jiàn)表1)，其中柴胡17個(gè)、香附18個(gè)、川芎7個(gè)、陳皮5個(gè)、枳殼5個(gè)、白芍13個(gè)、甘草92個(gè)，對(duì)成分靶點(diǎn)進(jìn)行整理后，共得到165個(gè)作用靶點(diǎn)，提取Degree≥10的靶點(diǎn)，獲得成分中核心靶點(diǎn)共44個(gè)。

2.2 乳腺癌靶點(diǎn)篩選及構(gòu)建共同靶點(diǎn)韋恩圖

通過(guò)搜索TTD數(shù)據(jù)庫(kù)，確立了138個(gè)與乳腺癌相關(guān)的治療靶點(diǎn)，Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)基因299個(gè)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，共得到乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)及基因共407個(gè)。建立柴胡疏肝散與乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖(見(jiàn)圖1)，獲取二者共同作用靶點(diǎn)15個(gè)，其中包括多種激素受體如雄激素受體(Androgen Receptor，AR)、雌激素受體(Estrogen Receptor，ESR)、孕激素受體(Progesterone Receptor，PGR)等及多種酶及因子(見(jiàn)表2)。

2.3 構(gòu)建蛋白互作圖

將15個(gè)共同靶點(diǎn)信息導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得蛋白互作信息，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件獲得蛋白互作圖(圖2)，圖中共有15個(gè)節(jié)點(diǎn)，41條邊，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì)，線條代表二者間相互作用，節(jié)點(diǎn)形狀越大，代表其degree值更高，線段越粗，代表二者間相互作用關(guān)系更強(qiáng)。如圖可知，JUN、PTGS2、ESR1為3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.4 構(gòu)建藥物活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用Cytoscape 3.2.1構(gòu)建柴胡疏肝散活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖3)，圖中左側(cè)圓圈內(nèi)節(jié)點(diǎn)為柴胡疏肝散157種有效活性成分，右側(cè)小圓圈內(nèi)節(jié)點(diǎn)為15個(gè)柴胡疏肝散與乳腺癌共同作用靶點(diǎn)。

表1 柴胡疏肝散活性成分表Table 1 Active ingredients list of Chaihu Shugan Powder

（續(xù)表1)

（續(xù)表1)

（續(xù)表1)

圖1 柴胡疏肝散活性成分靶點(diǎn)與乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)關(guān)系的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the relationship between the active components of targets of Chaihu Shugan Powder and the targets of breast cancer

2.5 GO功能注釋及分析

基于DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋，通過(guò)GO分析，共涉及52個(gè)生物過(guò)程、6種細(xì)胞成分、27個(gè)分子功能，篩選前10個(gè)作為關(guān)鍵功能注釋信息并繪制氣泡圖如圖4、圖5、圖6所示。柴胡疏肝散主要參與調(diào)控RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、藥物反應(yīng)、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路等10個(gè)生物過(guò)程，相關(guān)基因靶點(diǎn)富集于細(xì)胞核、核漿、細(xì)胞質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物6種細(xì)胞成分，發(fā)揮類固醇激素相關(guān)受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、特定序列DNA結(jié)合等10個(gè)分子功能。

表2 柴胡疏肝散與乳腺癌共同作用靶點(diǎn)Table 2 Common targets of Chaihu Shugan Powder and breast cancer

圖2 蛋白互作圖Figure 2 Protein interaction diagram

2.6 KEGG通路分析

圖3 柴胡疏肝散活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 The network diagram of active componentsdisease-targets of Chaihu Shugan Powder

基于DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，共獲得22條富集通路，為獲得關(guān)鍵富集通路進(jìn)行分析，選取前10條通路并繪制氣泡圖，結(jié)果如圖7顯示，圖中X軸為基因比例(Gene Ratio)，Y軸為富集通路名稱，點(diǎn)的大小代表涉及基因數(shù)目，點(diǎn)的顏色代表P值高低。可見(jiàn)，柴胡疏肝散核心靶點(diǎn)主要富集于癌癥相關(guān)通路、催乳激素、雌激素相關(guān)通路、脂肪細(xì)胞脂解通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，通過(guò)影響激素信號(hào)通路及抗血管生成相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮抗癌作用。

圖4 GO注釋分析生物過(guò)程氣泡圖Figure 4 The bubble diagram of biological process of GO analysis

圖5 GO注釋分析細(xì)胞組成氣泡圖Figure 5 The bubble diagram of cellular component of GO analysis

圖6 GO注釋分析分子功能分析氣泡圖Figure 6 The bubble diagram of molecular function of GO analysis

圖7 KEGG通路分析氣泡圖Figure 7 The bubble diagram of KEGG pathway analysis

3 分析

柴胡疏肝散為臨床疏肝解郁、理氣化瘀代表方，方中柴胡疏肝解郁為君藥，香附梳理三焦氣機(jī)，川芎活血通絡(luò)，陳皮、枳殼理氣健運(yùn)脾胃，甘草調(diào)和諸藥。臨床廣泛用于治療婦科疾病中肝郁氣滯、肝胃不和患者，女子以肝為先天，乳房作為肝經(jīng)所過(guò)之處，相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展與情志不暢、氣機(jī)郁結(jié)密切相關(guān)，且乳腺癌患者患病后多情志抑郁不暢，故臨證多通過(guò)疏肝散結(jié)法來(lái)治療乳腺癌。

蛋白互作圖中可見(jiàn)靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系，經(jīng)過(guò)篩選其主要關(guān)鍵靶點(diǎn)為JUN、PTGS2、ESR1。JUN是細(xì)胞周期正常進(jìn)行的必要組成成分，在正常情況下少量表達(dá)c-JUN蛋白，c-JUN基因受到刺激后發(fā)生異常表達(dá)，產(chǎn)生過(guò)量c-JUN蛋白，與c-Fos蛋白形成AP-1，影響細(xì)胞分化、增殖及凋亡[3]，在結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌中可見(jiàn)c-JUN蛋白過(guò)表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，c-JUN基因啟動(dòng)子區(qū)位點(diǎn)rs4646999可能通過(guò)增強(qiáng)c-JUN蛋白表達(dá)影響腸癌預(yù)后[4]。PTGS2為前列腺素G/H合酶2，是前列腺素合成的主要限速酶，PTGS2蛋白的上調(diào)與細(xì)胞粘附增加、抗凋亡、血管生成相關(guān)，在高密度的膠原基質(zhì)乳腺上皮細(xì)胞中可見(jiàn)PTGS2表達(dá)增加，與乳腺密度升高相關(guān)，參與促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[5]。ESR1基因?yàn)榇萍に厥荏w1基因，其編碼ERα蛋白，與雌激素相結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)激素水平。提示柴胡疏肝散可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、血管生成、激素水平影響乳腺癌進(jìn)程。

根據(jù)KEGG分析，柴胡疏肝散相關(guān)靶點(diǎn)主要富集于癌癥相關(guān)通路、催乳激素、雌激素相關(guān)通路、脂肪細(xì)胞脂解通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，通過(guò)影響激素信號(hào)通路及抗血管生成相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮抗癌作用。乳腺癌是激素依賴性腫瘤，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受多種激素分泌的影響，其中雌激素對(duì)乳腺癌的影響不言而喻，75%的乳腺癌是激素受體陽(yáng)性乳腺癌，內(nèi)分泌治療是臨床主要治療手段之一。催乳素與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展亦密切相關(guān)，催乳素(Prolactin，PRL)與受體結(jié)合后可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，在部分乳腺癌組織中可見(jiàn)PRL表達(dá)升高，乳腺癌細(xì)胞還可以通過(guò)自分泌或旁分泌PRL以促進(jìn)自身增殖、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[6]。PRL可介導(dǎo)PRLR-JAK/STAT5通路，增強(qiáng)雌激素敏感性，協(xié)同IGF-I、EGF家族配體激活下游通路誘導(dǎo)ERα磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化[7]。脂代謝功能紊亂和脂質(zhì)分解障礙是導(dǎo)致肥胖的主要原因，肥胖是乳腺癌的危險(xiǎn)因素之一。脂肪組織含有芳香化酶可產(chǎn)生雌二醇，并且脂肪組織也是腫瘤微環(huán)境中重要組成部分，與正常脂肪組織相比，腫瘤周圍脂肪組織發(fā)生了一系列變化，產(chǎn)生了不同的細(xì)胞類型，還可分泌多種因子促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、瘦素、腫瘤壞死因子等[8，9]。HIF-1是存在于人體內(nèi)缺氧條件下的重要轉(zhuǎn)錄因子，缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)HIF-1作用于靶基因血管上皮生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，參與腫瘤新生血管生成，促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程[10]。ErbB受體絡(luò)氨酸激酶家族在多種腫瘤中異常表達(dá)，ErbB 1、ErbB 2異常活化與腫瘤新生血管生成相關(guān)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化[11]。由上可知，柴胡疏肝散可通過(guò)調(diào)節(jié)激素相關(guān)信號(hào)通路影響激素水平發(fā)揮抗乳腺癌作用，而對(duì)于三陰性乳腺癌患者，對(duì)內(nèi)分泌治療不甚敏感，但臨證中，在以“謹(jǐn)守病機(jī)”為主的辨證治療原則下，柴胡疏肝散對(duì)于此種類型患者亦表現(xiàn)出良好的臨床療效。宋小青等[12]人觀察柴胡疏肝散加減聯(lián)合化療維持治療三陰性乳腺癌患者能有效提高患者5年無(wú)病生存率，減少?gòu)?fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。三陰性乳腺癌患者在常規(guī)化療基礎(chǔ)上聯(lián)合柴胡疏肝散可延長(zhǎng)患者生存期，改善生存質(zhì)量[13]。

綜上，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，對(duì)柴胡疏肝散與乳腺癌作用靶點(diǎn)之間進(jìn)行了分析及網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)圖構(gòu)建，結(jié)果顯示，柴胡疏肝散中活性成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，參與多種生物過(guò)程及信號(hào)通路，其中以影響激素水平及抗血管生成為主，干擾腫瘤進(jìn)程。但本研究仍存在一定的局限性，如未針對(duì)藥物組方原則、配伍關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步分析，且仍需開(kāi)展更多的臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)柴胡疏肝散治療乳腺癌的作用機(jī)制及靶點(diǎn)加以驗(yàn)證。