1例復(fù)合雜合突變導(dǎo)致遺傳性凝血因子Ⅺ缺陷癥家系的基因分析

方偉偉，郭躍麗，奚經(jīng)巧

（溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州 325015）

凝血因子Ⅺ （FⅪ），又稱為 “血漿凝血活酶前質(zhì)”，主要在肝細(xì)胞和巨核細(xì)胞中產(chǎn)生合成?？赏ㄟ^(guò)凝血酶、活化的凝血因子Ⅻ或自身裂解所激活，生成活化的FⅪ（FⅪa），進(jìn)而激活凝血因子Ⅸ，從而活化凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。遺傳性FⅪ缺陷癥為常染色體隱性遺傳，男女均可發(fā)病?；颊吲R床出血表現(xiàn)輕重不一，主要表現(xiàn)為創(chuàng)傷或手術(shù)后出血增多，鮮有明顯的自發(fā)性出血，且FⅪ活性（FⅪ：C）水平高低與出血程度并不相關(guān)[1]。目前認(rèn)為該疾病的發(fā)生與FⅪ的基因突變有關(guān)[2]。本研究通過(guò)對(duì)一個(gè)復(fù)合雜合性（F11）基因突變導(dǎo)致的遺傳性FⅪ缺陷癥家系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室表型檢測(cè)與基因突變定位分析，初步探討其分子致病機(jī)制。

1 病例介紹

先證者，男，28歲。2018年6月因腮腺良性腫瘤收住入院，術(shù)前凝血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）為84.2秒，進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)FⅪ：C 為 3%，F(xiàn)Ⅺ抗原（FⅪ：Ag）為 8.6%。其他相關(guān)凝血指標(biāo)均無(wú)明顯異常，肝、腎功能正常，初步診斷為“FⅪ缺陷癥”。征得先證者及其家系成員知情同意后調(diào)查先證者及其家系3代6人，均無(wú)自發(fā)性出血癥狀，先證者父母非近親結(jié)婚，家系遺傳圖譜詳見(jiàn)圖1。正常對(duì)照：選擇100例體檢健康者，年齡22-56歲，無(wú)肝、腎功能異常，且無(wú)其他基礎(chǔ)性疾病，其中男53例，女47例，用于排除基因多態(tài)性。

2 方法

2.1 樣品采集與處理 采集受檢者外周靜脈血2.7mL，采用0.109mol/L枸櫞酸鈉1:9抗凝，3000r/min離心10分鐘，留取上層乏血小板血漿用于凝血指標(biāo)檢測(cè)，下層血細(xì)胞用于提取基因組DNA。

圖1 遺傳性凝血因子Ⅺ缺陷癥家系圖

2.2 實(shí)驗(yàn)室表型檢測(cè) APTT、血漿凝血酶原時(shí)間（PT）、纖維蛋白原（FIB）、FⅪ：C、FⅧ活性（FⅧ：C）、FⅨ活性（FⅨ：C）、FⅫ活性（FⅫ：C）等凝血指標(biāo)采用一期凝固法在法國(guó)STAGO STA-R全自動(dòng)血凝儀上檢測(cè)（配套試劑由法國(guó)STAGO公司提供）；FⅪ：Ag采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

2.3 基因分析 DNA提取采用非離心柱型基因組DNA抽提試劑盒抽提先證者及家系成員的外周血基因組DNA。根據(jù)人類（F11）基因序列（GenBank AYl91837），應(yīng)用primer 5.0軟件共設(shè)計(jì)13對(duì)引物，以覆蓋（F11）基因的15個(gè)外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列。引物序列及PCR反應(yīng)條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽(yáng)性標(biāo)本純化后進(jìn)行測(cè)序（上海桑尼生物科技有限公司）。將測(cè)序結(jié)果與Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中（F11）基因序列（NG_008051.1）比對(duì)，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)后反向測(cè)序予以證實(shí)。先擴(kuò)增先證者（F11）基因各外顯子、側(cè)翼序列以及5′端、3′端非翻譯區(qū)，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)后再擴(kuò)增其他家系成員相應(yīng)外顯子片段。

2.4 氨基酸突變位點(diǎn)保守性分析 用ClustalX-2.1-win軟件將突變氨基酸與其他同源物種：黑猩猩（Pan troglodytes）、獼猴（Macaca mulatta）、家犬（Canis lupus familiaris）、牛 （Bos Taurus）、小 家 鼠（Mus musculus）、 褐 鼠 （Rattus norvegicus）、 原 雞（Gallus gallus）、熱帶爪蟾（Xenopus tropicalis）（同源物種氨基酸序列來(lái)源：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene）的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，分析突變氨基酸在物種進(jìn)化過(guò)程中的保守性。

2.5 氨基酸突變前后生物信息學(xué)特性分析 用MutationTaster（http：//www.mutationtaster.org）（蛋白質(zhì)參考ID：P00747和蛋白質(zhì)參考轉(zhuǎn)錄本ID：ENST00000308192）在線生物信息學(xué)軟件，通過(guò)評(píng)分結(jié)果預(yù)測(cè)基因突變對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響，分?jǐn)?shù)越接近1表明預(yù)測(cè)結(jié)果越可靠。

2.6 氨基酸突變前后蛋白質(zhì)局部空間構(gòu)，型變化分析 根據(jù)已知的FⅪ蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建突變后模型，針對(duì)突變位點(diǎn)用Swiss-PdbViewer軟件分析（F11）基因突變前后由氨基酸變化引起的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)室表型檢測(cè) 先證者的APTT為84.2秒，明顯延長(zhǎng)，其FⅪ：C和FⅪ：Ag均明顯下降，分別為3%和8.6%；家系成員中其父親、母親、祖父和外祖母的FⅪ：C和FⅪ：Ag均下降至參考值的一半左右，其母親和外祖母的APTT稍延長(zhǎng)于參考值，其他相關(guān)凝血指標(biāo)均無(wú)明顯異常。詳見(jiàn)表1。

表1 先證者及家系成員實(shí)驗(yàn)室表型檢測(cè)結(jié)果

3.2 基因分析 先證者（F11）的基因第7號(hào)外顯子存在c.738G＞A雜合無(wú)義突變導(dǎo)致p.Trp228stop，第12號(hào)外顯子存在c.1325delT缺失突變導(dǎo)致p.L424CfsX8。其母親和外祖母存在p.Trp228stop突變雜合子，其父親和祖父存在p.L424CfsX8突變雜合子。詳見(jiàn)圖2、表2。

圖2 （F11）基因第7和第12外顯子測(cè)序結(jié)果。2A：c.738G＞A 雜合無(wú)義突變；2B：c.738G 野生型；2C：c.1325delT缺失突變；2D：c.1325野生型。

表2 先證者及家系成員基因分析結(jié)果

3.3 同源性分析 ClustalX-2.1-win軟件保守性分析結(jié)果顯示，Leu424在同源物種間呈高度保守。詳見(jiàn)圖3。

圖3 Leu424同源性分析結(jié)果圖

3.4 突變對(duì)蛋白影響力評(píng)估 Mutation Taster對(duì)p.Leu424Cys的評(píng)分結(jié)果為1.000分，預(yù)示此突變可引起相關(guān)疾病。

3.5 模型分析 Swiss-PdbViewer軟件對(duì)FⅪ蛋白質(zhì)進(jìn)行模型分析發(fā)現(xiàn)，在野生型FⅪ蛋白質(zhì)中非極性疏水性的Leu424與Pro421之間有一個(gè)氫鍵連接；當(dāng)突變?yōu)闃O性親水性的Cys424后，原有的氫鍵沒(méi)有改變，但與Pro421的同一部位又多了一條氫鍵連接，導(dǎo)致蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。詳見(jiàn)圖4。

4 討論

成熟的FⅪ分子是由兩條多肽鏈通過(guò)二硫鍵連接形成的二聚體，F(xiàn)Ⅺ單鏈羧基端是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域（SP），氨基端由蘋果狀結(jié)構(gòu)域（AP）組成。遺傳性FⅪ缺陷癥主要與（F11）基因突變有關(guān)，在其突變的數(shù)據(jù)（http：//www.factorⅪ.com/）顯示：突變分布于（F11）基因的各結(jié)構(gòu)域，SP區(qū)的突變相對(duì)集中。FⅪ缺陷癥在一般人群中的發(fā)生頻率為1/10萬(wàn)～1/100萬(wàn)[3]，而后續(xù)的研究數(shù)據(jù)顯示：輕度FⅪ缺陷癥的發(fā)生率比預(yù)期的要高[4]。FⅪ缺陷癥的發(fā)病率與基因突變類型具有種族差異。該病在猶太人群中尤其高發(fā)，純合突變患者比例可高達(dá)1/190。人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù) （Human Gene Mutation Database，HGMD，http：/www.hgmd.cf.ac.uk/ac/a11．php）共收錄（F11）基因突變 240余種，其中78.3%為錯(cuò)義突變和無(wú)義突變，9.8%為剪切位點(diǎn)突變，7.4%為小片段的缺失，剩余4.5%則為其它類型突變。遺傳性FⅪ缺陷癥分為2型，F(xiàn)Ⅺ：Ag和FⅪ：C同步下降，屬于交叉反應(yīng)物質(zhì)（crossreation material，CRM）陰性型，若 FⅪ：C 降低而 FⅪ：Ag正常則為CRM陽(yáng)性型。本文通過(guò)對(duì)一個(gè)遺傳性FⅪ缺陷癥家系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室表型檢測(cè)與基因突變分析，共發(fā)現(xiàn)了2個(gè)基因突變，分別為c.738G＞A無(wú)義突變和c.1325delT缺失突變，均為CRM陰性型。

2003年武文漫等[3]首次報(bào)道位于AP3的c.738G＞A 雜合無(wú)義突變（p.Trp228stop）。Shao等[5]發(fā)現(xiàn)該突變?cè)?7個(gè)中國(guó)FⅪ缺陷癥家系最為常見(jiàn)，是中國(guó)人群FⅪ缺陷癥的熱點(diǎn)突變，且為中國(guó)人所特有。p.Trp228stop突變翻譯而成的是截短型蛋白，高度不穩(wěn)定并迅速被降解[6]。但也有研究認(rèn)為，該無(wú)義突變產(chǎn)生的含有提前終止密碼子的mRNA可被一種稱之為 “無(wú)義介導(dǎo)衰變的mRNA監(jiān)視系統(tǒng)”迅速降解，使得循環(huán)中FⅪ減少[7]。

圖4 FⅪ蛋白質(zhì)模型圖。4A：野生型；4B：突變型；綠色虛線為氫鍵。

Leu424位于第12號(hào)外顯子SP區(qū)域，c.1325delT即1325號(hào)位置的T堿基缺失導(dǎo)致424后所有的氨基酸發(fā)生移碼突變。氨基酸保守性分析顯示，Leu424殘基在同源物種間呈高度保守，提示它是FⅪ分子的一個(gè)重要功能性位點(diǎn)。MutationTaster生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件顯示此突變?yōu)橛泻ν蛔?，可?duì)蛋白質(zhì)功能造成一定的影響，從而引起相應(yīng)疾病。通過(guò)構(gòu)建氨基酸突變前后結(jié)構(gòu)模型可見(jiàn)424位Leu被Cys所替代并且在431位出現(xiàn)終止密碼子，導(dǎo)致編碼蛋白翻譯提前終止而產(chǎn)生截短蛋白。該蛋白因缺失部分結(jié)構(gòu)域，高度不穩(wěn)定，功能域的缺失及不穩(wěn)定性的增強(qiáng)影響了催化活性區(qū)[6]，這可能是FⅪ：C及FⅪ：Ag下降的原因。

先證者基因分析顯示，（F11）基因第7號(hào)外顯子存在c.738G＞A雜合無(wú)義突變導(dǎo)致p.Trp228stop，及第12號(hào)外顯子c.1325delT缺失突變導(dǎo)致p.L424CfsX8。其母親存在p.Trp228stop突變雜合子，其父親存在p.L424CfsX8突變雜合子，結(jié)合家系圖，先證者的p.Trp228stop雜合突變遺傳自其母親，p.L424CfsX8雜合突變遺傳自其父親。其父母為單一的雜合突變，F(xiàn)Ⅺ抗原與活性水平均降低至正常范圍的一半左右，雙重雜合突變導(dǎo)致先證者FⅪ抗原與活性水平極度降低，因此，該復(fù)合雜合突變與先證者FⅪ水平降低有關(guān)。有報(bào)道指出遺傳性FⅪ缺陷癥的單一純合突變和雙重雜合突變都可導(dǎo)致血漿FⅪ：C下降至15%以下，單一雜合突變的下降程度為15%～70%[8]，與本文家系中有基因缺陷的家系成員FⅪ：C下降程度一致。本文100例正常對(duì)照者的基因均未發(fā)現(xiàn)p.L424CfsX8，排除了基因多態(tài)性的可能，同時(shí)查閱相關(guān)網(wǎng)站和文獻(xiàn)，p.L424CfsX8突變尚未見(jiàn)報(bào)道。

綜上所述，本文通過(guò)對(duì)一個(gè)遺傳性FⅪ缺陷癥家系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室表型檢測(cè)和基因突變分析，發(fā)現(xiàn)了p.Trp228stop雜合無(wú)義突變和p.L424CfsX8雜合缺失突變，后者為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。該家系人員FⅪ水平減低與這兩種突變有關(guān)，但其確切的致病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。