miR-122-5p通過ADAM10基因抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲和轉移的研究

徐興遠，龍晶，張禎晶

（1.中南大學湘雅醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410008；2.中南大學醫(yī)學院 臨床醫(yī)學系，湖南 長沙 410008）

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，5 年生存率低于45%［1］。在卵巢癌早期，患者并無明顯癥狀。當癌癥進一步進展，相關癥狀才逐一顯出［2］。盡管有手術治療及放化療等手段，卵巢癌的預后仍不容樂觀。故此，尋找卵巢癌預防及治療的方法迫在眉睫。

微小核糖核酸（micro ribonucleic acid,miRNA）是一類單鏈非編碼核糖核酸，長度在18～24 個核苷酸之間。它們通過與信使核糖核酸（mRNA）的3'未翻譯區(qū)（3'untranslated region,3'UTR）序列特異性結合，來對mRNA 進行轉錄后的負向調(diào)節(jié)，進而在諸多生物進程中起到關鍵作用［3］。

一方面，微小核糖核酸122-5p（microRNA-122-5p,miR-122-5p）是脊椎類物種的特定miRNA，它與許多惡性腫瘤如胃癌［4-5］、乳腺癌［6］等存在關聯(lián)。另一方面，ADAM10 基因被證明參與了調(diào)節(jié)細胞表面蛋白功能的過程，它與參與腫瘤進展的諸多因子如表皮細胞生長因子（epidermal growth factor,EGF）、鈣黏附蛋白E（E-cadherin）和炎癥因子等相關［7］。

該研究闡明了miR-122-5p 在卵巢癌細胞增殖、轉移及凋亡中的作用，并進一步證明了miR-122-5p是通過與ADAM10 基因的mRNA 直接作用來調(diào)節(jié)細胞功能的。綜合而言，該研究證實miR-122-5p可以作為腫瘤抑制因子，有望成為未來的卵巢癌治療的新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

卵巢癌細胞系A2780 和SKOV3 購買于中科院生化細胞實驗室（中國，上海）。培養(yǎng)液采用DMED 培養(yǎng)液加10% 胎牛血清（FBS）（購于Invitrogen 公司，美國），抗生素選用100 u/mL 的青霉素和100 μg/mL 的鏈霉素（購于Hyclone 公司，美國），細胞培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳的溫箱。卵巢癌耐藥株A2780/DDP 為自己培育，保存于最終濃度為1 μg/L 的順鉑溶液中，方法參見文獻［6］。

1.2 RNA 提取及實時定量聚合酶鏈式反應

應用TRIzol 試劑（購于Invitrogen 公司，美國）根據(jù)標準流程提取RNA。關于ADAM10 的表達設計，通過第一鏈合成系統(tǒng)（Superscript First-Strand Synthesis System）（Invitrogen 公司）設計。應用的引物如下：正向引物5'-GCAATACTCGCCT TACGGCT-3'，反向引物5'-TACACACCTTGGTAGT ACGCC-3'；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）正向引物5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'，反向引物5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。其中GAPDH 作為對照。miR-122-5p 定量檢測通過TaqMan miRNA Assay（ABI 公司）按標準流程完成。U6 snRNA 作為內(nèi)對照。實時定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）完成于ABI 7900HT 儀器。所有的試驗均獨立完成3 次。

1.3 質(zhì)粒和慢病毒的構建

MiR-122-5p 過表達載體通過如下引物構建：正向引物5'-AAAGGATCCCAGGAGTTGTAAATCCG AGCCG-3'，反向引物5'-AAAGAATTCTTCATAGGT CAGAGCCCTGTGCA-3'，方法見文獻［6］。編碼ADAM10 蛋白的DNA 片段先經(jīng)PCR 擴增再載入pcDNA3，1 載體（Clontech,Palo Alto，美國），應用的引物如下：正向引物5'-AAAGCTAGCATGTTA GGAACTGTGAAGATGGAAG-3'，反向引物 5'-AAACTCGAGCTAGGAAGTGTTTAGGACGGGTCT-3'。Mir-122-5p 慢病毒通過用pPACKH1 Lentivector Packaging Kit（美國SBI 公司）共轉染HEK293T獲得，見文獻［6］。為產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞株，細胞轉染慢病毒24 h，并更換完全培養(yǎng)液。轉染后96 h，用qRT-PCR 確認轉染效率。

1.4 熒光素酶活性試驗

含野生型或突變型ADAM10 基因的熒光素酶報告基因載體，與含miR-122-5p 的HEK293T 細胞共轉染。轉染后48 h 洗脫、裂解并通過雙重熒光酶報告試劑（Promega,Madison，美國）按標準流程分析。

1.5 細胞活性、集落形成和細胞凋亡的測定

細胞活性通過細胞計數(shù)盒CCK8 計算。細胞種于96 孔板，1×103細胞/孔，容量100 μL 培養(yǎng)液。每孔加入10 μL CCK 試劑，分光光度計于450 nm 波長測定光密度（optical density,OD）值。

集落形成試驗。細胞種于6 孔板，800 細胞/孔，孵育14 d。之后每3 日更換含10%FBS 的培養(yǎng)液，觀察生成的細胞集落。超過40 個細胞的集落計算在內(nèi)，觀察四個象限，并計算平均值。另外，水晶紫染色后拍照以便展示。

細胞凋亡通過凋亡檢測盒完成［Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit（Millipore，美國）］。細胞標本收集后，用5 μL 膜連蛋白V-PE 和5μL PI 染色。通過流式細胞學檢測細胞的凋亡，結果通過Cell-QuestTM Pro 軟件分析。收集預處理的細胞，于70%濃度的乙醇在4℃過夜，后懸浮于1 mL 含1 mg/mL RNase（Sigma,St.Louis，美國）和50 μg/mL PI 試劑的PBS 溶液中，室溫暗箱孵育30 min。

1.6 細胞遷移和侵襲試驗

細胞遷移和侵襲能力測定采用標準的Transwell 試驗。將3×104細胞置于100 μL 無血清培養(yǎng)液內(nèi)，加入試驗板的上層。600 μL 含10%FBS培養(yǎng)液置于下層。分別于12 或36 h 后，細胞固定并用0.05%水晶紫染色計數(shù)。顯微鏡下200 倍拍照以便展示。

1.7 Western Blot

細胞收集后裂解，共分離出60 μg 蛋白，置于10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜。用1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）于TBST 緩沖液中室溫孵育1 h 封閉。加入ADAM10、BCL-2 及Cyclin D1 蛋白的抗體，和GAPDH 于4℃過夜。洗膜，加入羊抗兔、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h。蛋白條帶通過增強化學熒光試劑ECL（Millipore,MA，美國） 檢測，并通過圖像J（Image J）軟件分析。

1.8 統(tǒng)計學方法

所有的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)應用SPSS 19，0 軟件進行分析計算。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，應用t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-122-5p 抑制卵巢癌細胞體外增殖

將卵巢癌細胞系SKOV3 和A2780 轉染miR-122-5p，或轉染空白載體作為各自對照組，并通過qRT-PCR 證實成功轉染的效果（P＜0.01），見圖1。此后，評估轉染后細胞的活性和增殖能力。結果表明，轉染3 日后，與對照組相比，轉染了miR-122-5p 的SKOV3 和A2780 細胞的活性明顯降低（P＜0.01），見圖2；另外，細胞集落形成能力也大大降低了，見圖3?？傮w上，這些結果證明了miR-122-5p 抑制卵巢癌細胞的體外增殖。

圖1 SKOV3 和A2780 卵巢癌細胞轉染miR-122-5p 的情況

圖2 SKOV3 和A2780 卵巢癌細胞轉染miR-122-5p 后活性的變化

圖3 SKOV3 和A2780 卵巢癌細胞轉染miR-122-5p 后形成集落能力的變化

2.2 miR-122-5p 誘導卵巢癌細胞凋亡

上述證明了miR-122-5p 抑制卵巢癌細胞增殖，針對此點深入研究，闡述miR-122-5p 對卵巢癌細胞凋亡過程的影響。以轉染空白載體作為對照組，轉染miR-122-5p 后，SKOV3 和A2780 卵巢癌細胞的凋亡率明顯增加（P＜0.01），見圖4。并且，轉染miR-122-5p 后的SKOV3 和A2780 細胞較對照組有更高的Bax 表達和更低的BCL-2 及Cyclin D1表達，見圖5。其中，Bax 是凋亡起始的重要蛋白，BCL-2 抑制細胞凋亡，Cyclin D1 促進細胞周期進展。

圖4 SKOV3 和A2780 卵巢癌細胞轉染miR-122-5p 后的凋亡率變化

圖5 SKOV3 和A2780 卵巢癌細胞轉染miR-122-5p 后Bax、BCL-2 及Cyclin D1 表達的變化

2.3 miR-122-5p 抑制卵巢癌細胞的體外侵襲轉移能力

細胞增殖能力是評估腫瘤惡性程度的重要指標，但仍不全面，因為仍需考慮到腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。試驗結果證明，以轉染空白載體作為對照組，轉染miR-122-5p 后的SKOV3 細胞和A2780 細胞的侵襲轉移能力均大幅下降（P＜0.01），見圖6。

圖6 卵巢癌細胞轉染miR-122-5p 后侵襲及遷移能力的改變

2.4 ADAM10 是miR-122-5p 的直接靶基因

上述已闡明了miR-122-5p 能抑制卵巢癌細胞增殖和侵襲轉移，仍需進一步尋找其作用靶點。該研究通過TargetScan 工具尋找到ADAM10 的3'UTR 可能是miR-122-5p 的作用位點。同時設計出該結合位點的突變體結構，見圖7，后文中分別以野生型ADAM10 和突變型ADAM10 來區(qū)分。試驗采用SKOV3 卵巢癌細胞，分為轉染miR-122-5p組和轉染空白載體的對照組，此外每組細胞亦轉染野生型ADAM10 或突變型ADAM10 基因，應用熒光素酶檢測方法判定miR-122-5p 對ADAM10 基因表達的調(diào)控作用。結果表明，在轉染野生型ADAM10 基因的SKOV3 卵巢癌細胞中，共轉染miR-122-5p 的細胞相比于對照組具有明顯降低的熒光素酶活性（P＜0.01）；另一方面，在轉染突變型ADAM10 基因的SKOV3 卵巢癌細胞中，共轉染miR-122-5p 的細胞與對照組相比，熒光素酶活性無明顯差異，見圖8。

圖7 miR-122-5p 的靶基因預測

圖8 共轉染miR-122-5p 及野生型或突變型ADAM10基因后卵巢癌細胞的熒光素酶活性比較

進一步測定ADAM10 基因在轉染miR-122-5p后的表達情況的變化。同樣以轉染空白載體作為對照組，兩種細胞系SKOV3 和A2780 在轉染miR-122-5p 后，較對照組細胞ADAM10 mRNA 水平均明顯下降（二者均P＜0.01），見圖9，翻譯的蛋白量亦明顯下降（二者均P＜0.01），見圖10。上述結果表明miR-122-5p 直接作用于ADAM10 基因并抑制其表達。

2.5 miR-122-5p 調(diào)節(jié)卵巢細胞于體外對順鉑的敏感性

接下來評估卵巢癌細胞miR-122-5p 表達水平與其化療敏感性的關系。試驗采用順鉑耐藥卵巢癌細胞株A2780/DDP，對照組為普通的順鉑敏感的A2780 細胞株。結果表明，相比于對照組，A2780/DDP 細胞的miR-122-5p 表達水平明顯下降（P＜0.01），見圖11。進一步將耐藥株A2780/DDP轉染miR-122-5p，并以轉染空白載體為對照組，通過qRT-PCR 驗證順鉑耐藥株A2780/DDP 卵巢癌細胞轉染miR-122-5p 成功（P＜0.01），見圖12A。此后發(fā)現(xiàn)，耐藥株A2780/DDP 轉染miR-122-5p后，相比與對照組，其順鉑的半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration 50,IC50）明顯下降（P＜0.01），見圖12B。最后，試驗表明了A2780/DDP 轉染miR-122-5p 后，比對照組細胞的凋亡率明顯上升（P＜0.01），見圖12C。綜合起來，這些結果闡明了增加miR-122-5p 的表達會提高卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。

圖9 卵巢癌細胞轉染miR-122-5p 后ADAM10 mRNA含量的變化

圖10 卵巢癌細胞轉染miR-122-5p 后ADAM10 基因表達蛋白含量下降

圖11 普通細胞株A2780 和耐藥株A2780/DDP 卵巢癌細胞所含miR-122-5p 表達量區(qū)別

圖12 卵巢癌細胞轉染miR-122-5p 后對順鉑的敏感性

3 討論

miR-122-5p 作用廣泛，目前已證明其在急性心肌損傷［8］、肝損傷［9］及鼠骨間充質(zhì)干細胞分化中起到重要作用［10］。它還與脂肪肝和脂蛋白代謝有關［11］，白介素22 介導miR-122-5p 促進角蛋白形成細胞的增殖［12］。同樣地，很多研究表明miR-122-5p 與惡性腫瘤相關，如胃癌［4-5］、乳腺癌［6］等。故該研究旨在發(fā)現(xiàn)miR-122-5p 對卵巢癌的作用及機制。

該研究證明了miR-122-5p 通過負向調(diào)節(jié)ADAM10 基因的表達，能抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲和轉移。這與其他研究中miR-122-5p 與ADAM10基因對腫瘤細胞起到的作用相一致。比如上述提到的，胃癌中過表達miR-122-5p 與更小的腫瘤體積和更早的腫瘤分期是正相關的［4］。又如有研究發(fā)現(xiàn)沉默ADAM10 基因對胰腺癌細胞的活性無明顯影響，但明顯降低了癌細胞侵襲和轉移的能力［13］。

順鉑耐藥是臨床進展期卵巢癌化療面臨的首要困難之一，諸多試驗從各種方向嘗試解決化療耐藥問題，可惜的是目前仍無較好的辦法［14-15］。該研究嘗試從miRNA 角度探討其與化療耐藥的關聯(lián)。幸運的是研究證明了順鉑耐藥細胞株A2780/DDP 有較低的miR-122-5p 表達水平，過表達miR-122-5p 可以增加耐藥株A2780/DDP 的凋亡率，并降低順鉑的半數(shù)抑制量（IC50）。為進一步研究卵巢癌化療耐藥機制及解決辦法提供一些思路。

然而該試驗仍有可以繼續(xù)完善之處。首先，該研究僅僅停留在分子生物學和細胞學試驗層面，動物學試驗有待進一步開展。動物學試驗的結果，是指導該研究成果轉化為臨床應用手段的不可或缺的基礎。這一點對于miR-122-5p 能否幫助解決臨床上卵巢癌鉑類耐藥的問題尤為重要。而且在體內(nèi)試驗中印證miR-122-5p 有效性的同時，也有機會觀察其安全性。因為miRNA 在體內(nèi)作用廣泛，并非僅針對腫瘤細胞，故在明確miR-122-5p 對腫瘤作用的同時，也需要重視過表達miR-122-5p 是否會對機體產(chǎn)生明顯的副作用。這可以在動物實驗中進行初步觀察和判斷。比如荷瘤動物在引入過表達miR-122-5p后，是否出現(xiàn)體重下降更快或生存時間更短的現(xiàn)象。

此外，miR-122-5p 在卵巢癌流行病學中的作用需要進一步闡明。若能充分結合臨床數(shù)據(jù)，闡述miR-122-5p 與患者癌癥分期、預后、化療敏感性以及腫瘤復發(fā)等方面的相關性，將能在后續(xù)試驗中更加有方向性的深入研究miR-122-5p 對卵巢癌的作用及相關機制。

綜上所述，本研究闡述了miR-122-5p 作為腫瘤抑制因子起作用，可以抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和轉移，并能降低其對順鉑的耐藥性。這可能成為未來治療卵巢癌的靶點。后續(xù)試驗仍有待進一步開展。