張 靜,袁宇琳,熊 雯(成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院,四川 成都 610000)
卡馬西平(carbamazepine,CBZ)為三環(huán)類抗癲癇藥物,是治療癲癇單純及復(fù)雜部分性發(fā)作的首選藥之一,在臨床上被廣泛應(yīng)用。由于卡馬西平治療窗窄,個(gè)體差異大,在臨床上常需要進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring,TDM)以保證藥物治療的安全性和有效性[1]。為提高藥代動(dòng)力學(xué)生物樣品檢測質(zhì)量,衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心(以下簡稱臨檢中心)自2014年起,在全國范圍內(nèi)開展藥代動(dòng)力學(xué)檢驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)(以下簡稱室間質(zhì)評(píng)),評(píng)價(jià)項(xiàng)目為人血漿中CBZ的濃度測定[2]。本研究建立并驗(yàn)證了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定人血漿中CBZ濃度方法,本方法特異性好,精密度高,準(zhǔn)確度好,使用該方法測定的室間質(zhì)評(píng)樣品結(jié)果順利通過了考核,可供參與此項(xiàng)室間質(zhì)評(píng)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室參考。
卡馬西平對(duì)照品(EDQM,批號(hào):006539,含量:99.9%),卡馬西平-d8(carbamazepine-d8, CBZ-d8)對(duì)照品(加拿大TRC公司,批號(hào):18-MVI-22-3,含量:96%),乙腈、甲酸為色譜純級(jí),水為超純水,空白人血漿購自Bioreclamation IVT公司(抗凝劑為K2EDTA)。
LC-30A型超高效液相色譜儀(日本島津公司),Triple Quad 5500質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司),XPE105型電子分析天平(法國METTLER TOLEDO公司),5810R型超速離心機(jī)(德國Eppendorf公司),VORTEX-T GENIE 2型旋渦混合器(美國SCIENTIFIC INDUSTRIES公司)。
色譜柱為Waters Xselsect?CSHTMC18柱(75 mm×2.1 mm,2.5 μm),流動(dòng)相A為含0.05%甲酸的水溶液,流動(dòng)相B為含0.05%甲酸的乙腈溶液,梯度洗脫(0→0.8 min,A:95%→2%;0.8→2.0 min,A:2%;2.0→2.2 min,A:2%→95 %;2.2→3.1 min,A:95%),流速0.3 mL·min-1,柱溫40 ℃。
采用電噴霧離子源(ESI),多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)正離子模式。離子源溫度500 ℃,離子噴霧電壓5500 V,輔助加熱氣壓力50 psi,霧化氣壓力50 psi,氣簾氣壓力35 psi,碰撞氣9 psi,去簇電壓10 V,碰撞電壓28 V。用于定量分析的離子對(duì)分別為:m/z237.1→194.1(CBZ),m/z245.0→202.1(CBZ-d8)。
精密稱取CBZ對(duì)照品10 mg,用乙腈溶解并定容至100 mL,得濃度為100 μg·mL-1的CBZ儲(chǔ)備液;取CBZ儲(chǔ)備液加水進(jìn)行稀釋,配得所需濃度的系列CBZ標(biāo)準(zhǔn)工作液。
取CBZ-d8對(duì)照品1 mg(一個(gè)包裝),用乙腈溶解并定容至100 mL,得濃度為10 μg·mL-1的CBZ-d8儲(chǔ)備液;取CBZ-d8儲(chǔ)備液加水進(jìn)行稀釋,配得CBZ-d8濃度為500 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。
取血漿樣品50 μL,加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液,旋渦混合15 s后,再加入340 μL乙腈,旋渦混合30 s后,于12 000 g、4 ℃離心10 min,吸取上清液20 μL,再加入0.05%甲酸水溶液380 μL稀釋,旋渦混合15 s,取100 μL至進(jìn)樣瓶中,進(jìn)樣2 μL。
在本實(shí)驗(yàn)條件下,考察了6個(gè)來源的血漿,結(jié)果顯示6個(gè)來源的血漿在CBZ和內(nèi)標(biāo)出峰處均無內(nèi)源性物質(zhì)干擾,CBZ及內(nèi)標(biāo)峰形良好,保留時(shí)間均為1.70 min。表明該方法選擇性良好,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。
用空白血漿加CBZ標(biāo)準(zhǔn)工作液,分別配制得到濃度為5、10、20、50、100、300、800、1000 ng·mL-1的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理,進(jìn)樣分析。以CBZ濃度為橫坐標(biāo)(x),CBZ與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(y),采用加權(quán)(1/x2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸,CBZ連續(xù)3天的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程見表1。結(jié)果表明,CBZ在5~1000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(r)范圍為0.999 3~0.999 9。
配制定量下限濃度的血漿樣品6份,按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理,進(jìn)樣分析,連續(xù)測定3 d。批內(nèi)精密度為2.66%~4.10%,批內(nèi)準(zhǔn)確度為101.05%~106.33%,批間精密度為3.71%,批間準(zhǔn)確度為103.38%。
表1 線性回歸方程Tab 1 Linear regression equation
在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度(1000 ng·mL-1)血漿樣品進(jìn)樣后,再進(jìn)樣空白樣品以評(píng)價(jià)殘留效應(yīng)。測定結(jié)果為卡馬西平的峰面積低于定量下限的20%,內(nèi)標(biāo)峰面積低于樣品的5%,表明該方法殘留效應(yīng)小,殘留對(duì)分析無影響。
配制4個(gè)濃度(15、50、500、750 ng·mL-1)的質(zhì)控血漿樣品各6份,按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理,進(jìn)樣分析,連續(xù)測定3 d,計(jì)算批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度和精密度見表2。結(jié)果表明,該方法批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度和精密度良好。
表2 批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度.n=6Tab 2 Intra-day and inter-day precisions and accuracies.n=6
取6個(gè)不同來源的血漿,按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理獲得空白上清液,分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制4個(gè)濃度(15、50、500、750 ng·mL-1)的血漿樣品各3份,進(jìn)樣分析,記錄峰面積為AM。用水代替血漿加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液配得相應(yīng)的溶液樣品,進(jìn)樣分析,記錄峰面積為AW?;|(zhì)效應(yīng)=AM/AW×100 %,內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)=CBZ基質(zhì)效應(yīng)/內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)×100%。結(jié)果見表3,6種不同來源的血漿CBZ和內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)均較小,表明該方法基質(zhì)效應(yīng)小,血漿基質(zhì)不干擾測定。
配制4個(gè)濃度(15、50、500、750 ng·mL-1)的質(zhì)控血漿樣品各6份,按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理,進(jìn)樣分析,記錄峰面積為AE。取空白血漿按“1.5”項(xiàng)下處理獲得空白上清液,分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制相應(yīng)濃度的的血漿樣品各6份,進(jìn)樣分析,記錄峰面積為AS?;厥章?AE/AS×100%。結(jié)果顯示,CBZ濃度為15、50、500、750 ng·mL-1時(shí),回收率依次為97.77%、102.02%、98.74%、100.89%,內(nèi)標(biāo)(500 ng·mL-1)回收率為99.13%,表明該方法回收率良好。
配制濃度為1500 ng·mL-1的血漿樣品各6份,用空白血漿稀釋2倍得到濃度為750 ng·mL-1的質(zhì)控血漿樣品,按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理,進(jìn)樣分析。稀釋2倍的血漿樣品與理論值的準(zhǔn)確度偏差為–1.33%,RSD為2.22%,表明樣品稀釋2倍測定不影響該方法的精密度與準(zhǔn)確度。
配制濃度為15、750 ng·mL-1的質(zhì)控血漿樣品各6份,分別考察血漿樣品2次凍融(–80 ℃冷凍,取出后室溫解凍,重復(fù)2次)、室溫放置(日光,6 h)、進(jìn)樣室放置(10 ℃,11 h)穩(wěn)定性和自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣3次重復(fù)性。將處理后樣品的測定結(jié)果與理論濃度進(jìn)行比較,結(jié)果見表4。結(jié)果表明,血漿樣品反復(fù)凍融2次、室溫放置6 h和進(jìn)樣室放置11 h均穩(wěn)定,自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣重復(fù)性良好。
表3 CBZ和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng).±s,n=3Tab 3 Matrix effects of carbamazepine and internal standard.±s,n=3
表3 CBZ和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng).±s,n=3Tab 3 Matrix effects of carbamazepine and internal standard.±s,n=3
基質(zhì)編號(hào)內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)/%01 104.47±1.62 101.19±1.68 102.45±1.31 101.76±0.73 103.22±0.13 099.87±0.25 107.12±2.10 106.42±1.01 103.23±0.53 02 103.66±0.68 100.37±0.59 102.74±0.22 102.80±1.32 104.93±0.93 100.67±0.20 109.18±1.98 107.43±3.16 103.26±0.67 03 103.01±1.46 100.62±0.68 102.29±0.46 102.81±0.74 103.07±0.70 101.08±0.20 107.32±2.45 106.59±2.55 102.37±1.55 04 100.96±1.45 100.07±1.40 100.36±0.70 101.65±0.68 102.95±0.41 101.47±0.58 106.46±1.94 107.60±1.28 100.88±0.06 05 100.93±0.90 099.83±0.78 099.08±0.78 101.77±0.69 101.10±1.70 100.80±0.73 102.09±2.83 104.05±1.17 101.10±0.75 06 100.69±0.98 100.76±0.28 099.43±0.56 102.61±0.49 100.09±0.41 100.26±0.25 103.88±1.52 106.76±1.63 099.93±1.03 750 ng·mL-1 500 ng·mL-1 75 ng·mL-1 15 ng·mL-1 500 ng·mL-1 CBZ基質(zhì)效應(yīng)/%CBZ內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子/%CBZ基質(zhì)效應(yīng)/%CBZ內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子/%CBZ基質(zhì)效應(yīng)/%CBZ內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子/%CBZ基質(zhì)效應(yīng)/%CBZ內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子/%
表4 樣品穩(wěn)定性和進(jìn)樣重復(fù)性結(jié)果.±s,n=6Tab 4 Results of sample stability and injection reproducibility.±s,n=6
表4 樣品穩(wěn)定性和進(jìn)樣重復(fù)性結(jié)果.±s,n=6Tab 4 Results of sample stability and injection reproducibility.±s,n=6
理論濃度/ng·mL-1凍融2次 室溫放置6 h 進(jìn)樣室放置11 h 重復(fù)進(jìn)樣3次準(zhǔn)確度/% CV/% 準(zhǔn)確度/% CV/% 準(zhǔn)確度/% CV/% 準(zhǔn)確度/% CV/%15 096.4±2.21 2.30 097.49±1.30 1.33 96.06±3.17 3.30 94.45±3.42 3.62 750 102.49±0.59 0.58 101.28±1.82 1.80 99.99±1.12 1.12 99.99±0.64 0.64
按“1.5”項(xiàng)下處理臨檢中心送檢的5個(gè)未知濃度CBZ血漿樣品,進(jìn)樣分析,具體結(jié)果見表5。質(zhì)評(píng)結(jié)果表明,所有質(zhì)評(píng)樣品測定結(jié)果均在允許范圍內(nèi)。
表5 室間質(zhì)評(píng)中5個(gè)樣品的測定結(jié)果Tab 5 Results of 5 samples in external quality assessment
目前,文獻(xiàn)報(bào)道的卡馬西平血藥濃度測定方法主要有免疫分析法[3]、高效液相色譜-紫外(HPLC-UV)法[4-5]、高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-DAD)法[6]和液質(zhì)聯(lián)用法[7]。
其中,免疫分析法操作簡便快速、自動(dòng)化程度高,適用于臨床急癥的快速分析;但選擇性不佳,代謝物易干擾藥物濃度的測定,且依賴于進(jìn)口試劑盒,分析成本較高。HPLC-UV法和HPLC-DAD法選擇性強(qiáng)、靈敏度高,但分析物和干擾物質(zhì)必須達(dá)到色譜分離才能準(zhǔn)確定量,方法開發(fā)時(shí)對(duì)預(yù)處理和色譜條件要求較高,且靈敏度低于液質(zhì)聯(lián)用法;謝燕如等[8]報(bào)道的反相高效液相色譜法測定人血漿中卡馬西平濃度,其定量下限為1000 ng·mL-1,單個(gè)樣品分析時(shí)間為7 min。液質(zhì)聯(lián)用法較HPLC法分析時(shí)間更短,選擇性更好,靈敏度更高,孫曉清等[9]報(bào)道的UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測人血漿中卡馬西平和苯巴比妥濃度,卡馬西平定量下限可達(dá)10 ng·mL-1,單個(gè)樣品分析時(shí)間為3 min。本研究確定的液-質(zhì)聯(lián)用法定量下限為5 ng·mL-1,單個(gè)樣品分析時(shí)間為3.1 min,操作簡便快速、專屬性好、靈敏度高,適用于低濃度樣品的快速測定。
本研究在選擇流動(dòng)相時(shí),考察了不同水相:0%、0.05%、0.10%、0.20%濃度的甲酸水溶液,不同有機(jī)相:甲醇、乙腈以及含不同濃度甲酸的甲醇、乙腈溶液,最終確定水相為含0.05%甲酸的水溶液,有機(jī)相為含0.05%甲酸的乙腈溶液進(jìn)行梯度洗脫,分析時(shí)間為3.1 min,色譜峰形良好,無內(nèi)源性物質(zhì)干擾,分析時(shí)間短。在開發(fā)樣品預(yù)處理方法時(shí),考察了不同沉淀劑及體積,顯示乙腈沉淀效果優(yōu)于甲醇,優(yōu)化得到的乙腈加入體積既保證沉淀效果也保證待測物響應(yīng)。沉淀后上清液中加入0.05%甲酸水溶液作為稀釋液,可以降低生物基質(zhì)對(duì)質(zhì)譜檢測器的干擾,同時(shí)水相的加入大大改善了色譜峰形。本研究采用CBZ-d8為內(nèi)標(biāo),內(nèi)標(biāo)與待測物結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)相似,在處理過程中提取率一致、質(zhì)譜響應(yīng)相似,使得該方法重現(xiàn)性良好,批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度良好,回收率高,基質(zhì)效應(yīng)低。
通過建立的方法測定5個(gè)質(zhì)評(píng)樣品全部通過,且與靶值偏差小于4.5%,表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠。分析質(zhì)評(píng)結(jié)果可知,實(shí)測值較理論值存在正偏差,提示該方法可能存在一定的系統(tǒng)誤差,也可能為質(zhì)評(píng)樣品在運(yùn)輸和存放過程水分減少樣品濃縮導(dǎo)致。同時(shí),質(zhì)評(píng)結(jié)果還顯示高濃度樣品的偏差較低濃度更大,可能是由于線性擬合時(shí)采用加權(quán)(1/x2)最小二乘法,使得擬合方程時(shí)更偏重于低濃度導(dǎo)致。
綜上,本研究建立并驗(yàn)證了UPLC-MS/MS法測定人血漿中CBZ濃度,該方法簡單快速、靈敏度高、特異性好、重現(xiàn)性好,符合臨檢中心關(guān)于藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物樣品檢測的要求,尤其適用于低濃度血漿樣品的快速分析,可應(yīng)用于室間質(zhì)評(píng)、TDM及人體生物藥代動(dòng)力學(xué)樣品測定。