油菜黑脛病菌（Leptosphaeria biglobosa）T-DNA插入突變體表型特征分析

史志丹，宋培玲，郝麗芬，皇甫海燕，燕孟嬌，楊永青，吳 晶，趙麗麗，李子欽

（1.內(nèi)蒙古大學生命科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010070；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院植物保護研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

油菜黑脛病是一種重要的真菌病害[1]，寄主范圍廣泛，能侵染多科植物，但主要侵染十字花科植物[2-3]。油菜黑脛病菌可以通過感染的油菜莖稈在季節(jié)與季節(jié)、作物與作物之間傳播，油菜的子葉、真葉、莖稈、根以及莢果等都有可能被黑脛病原菌侵染，造成幼苗或成株死亡并導致菜籽產(chǎn)量和品質(zhì)降低[4-6]。致病菌為強侵染型（Leptosphaeria maculans）和弱侵染型（Leptosphaeria biglobosa）的復合種，強侵染型黑脛病菌（L. maculans）在培養(yǎng)基上的生長速度較慢，形成白色平坦菌落，分生孢子器相對較少，釋放黃色至深棕色的色素。弱侵染型（L. biglobosa）黑脛病菌在培養(yǎng)基上的生長速度較快，菌落規(guī)則，分生孢子器相對較多，但主要集中在菌落中央，菌絲的氣生部分會形成黃色或褐色的液體小滴[7-8]。因此，不同的菌株在菌株致病性強弱、菌落生長速度、分生孢子器產(chǎn)生的數(shù)量、色素物質(zhì)的形成和積累上都有差異。目前，在我國尚未發(fā)現(xiàn)L. maculans，但L. biglobosa 作為油菜的一種病害已經(jīng)在我國普遍發(fā)生，并對長江流域的油菜產(chǎn)區(qū)造成了一定的經(jīng)濟損失，而對油菜黑脛病的防治工作剛剛起步[9-10]。因此，揭示黑脛病菌與油菜互作過程對于研究黑脛病的致病機理具有重要意義。筆者對黑脛病菌（L.biglobosa）T-DNA 插入突變體的主要表型進行了鑒定，旨在為后續(xù)黑脛病菌與油菜互作機制的研究提供材料基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試油菜品種為甘藍型油菜青雜5 號。原始菌株黑脛病菌株（L. biglobosa）nm-1 由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院植物保護研究所分離保存并經(jīng)分子生物學鑒定為L. biglobosa。供試菌株是本課題組利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得的GFP 標記的黑脛病菌突變體。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

主要試劑溴甲酚綠（Bromocresol green）、剛果紅（Congo red）、 羧甲基纖維素（Craboxy methyl cellulose）、果膠（Pectin from apple）、可溶性淀粉、脫脂奶粉均購自Biotopped 公司。培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，查比克培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 突變體生長速度測定及菌落形態(tài)觀察 接種突變體于PDA 平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7～12 d，于12 d觀察記錄菌落形態(tài)，并用十字交叉法測量菌落直徑，設3 次重復，野生型黑脛病菌株nm-1 為對照。

1.3.2 突變體產(chǎn)孢量測定 接種突變體于PDA 平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。在平板上添加3 mL 無菌水，靜置10 min 后，用載玻片輕輕刮平板表面，用雙層無菌紗布過濾獲得孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)孢子量[11]，設3 次重復，野生型黑脛病菌株nm-1 為對照。

1.3.3 突變體致病力測定 在供試油菜子葉期采用穿刺法接種，在傷口處接種10 μL 分生孢子懸浮液，孢子懸浮液濃度為1×106個/mL。20 ℃黑暗條件下套袋保濕48 h，在16 h 光照/8 h 黑暗條件下培養(yǎng)8 d后，以野生型黑脛病菌株nm-1 為對照，參考李欣洲[12]的油菜黑脛病病情分級標準來統(tǒng)計油菜發(fā)病情況。

1.3.4 生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)間的相關性 利用軟件SPSS 24.0 對突變體的生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)進行相關性分析。

1.3.5 突變體胞外酶檢測 將待測突變體接種于以下不同培養(yǎng)基平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)12 d。以野生型黑脛病菌株nm-1 為對照，通過比較菌落外圍透明圈的大小和有無，來檢測不同菌株間胞外酶分泌的差異，具體方法如下：（1）將待測菌株接種于含有1%脫脂奶粉的查比克培養(yǎng)基上，觀察不同菌株蛋白酶分泌的差異。（2）將待測菌株接種于含有0.1%可溶性淀粉的查比克培養(yǎng)基上，用1∶100 的I2/KI（0.08 mol/L I23.2 mol/L KI）染色10 min，依次用75%的乙醇洗脫2 次，無菌水洗脫2 次，觀察不同菌株淀粉酶分泌的差異。（3）將待測菌株接種于含有1%果膠的查比克培養(yǎng)基上，用0.005%的溴甲酚綠染色后，觀察不同菌株果膠酶分泌的差異。（4）將待測菌株接種于含有1%纖維素的查比克培養(yǎng)基上，用20 mL（0.1%）的剛果紅溶液染色20 min，依次用無菌水洗脫兩次，用20 mL NaC（l1 mol/L）脫色兩次，每次20 min。觀察不同菌株纖維素酶分泌的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體菌落形態(tài)觀察

前期試驗通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化獲得121 個突變體，對突變體的菌落形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)突變體菌落形態(tài)與野生型黑脛病菌株nm-1相近，只有6 個突變體與野生型黑脛病菌株nm-1菌落形態(tài)差異較為明顯。菌落形態(tài)如圖1 所示，有3 個突變體T21、T29、T30 與野生型黑脛病菌株nm-1菌落形態(tài)有明顯差異，其中突變體T21 和T30 菌落邊緣呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，而突變體T29 在PDA 平板上培養(yǎng)12 d 后，菌落未在培養(yǎng)基上生長。與野生型黑脛病菌株nm-1 相比，突變體T34 菌絲生長狀態(tài)和孢子分布相近，突變體T1、T12、T21、T29、T30、T35的菌絲生長狀態(tài)和孢子分布具有明顯差異。突變體T1、T34、T35 產(chǎn)孢量與野生型黑脛病菌株nm-1 相近，突變體T12、T21、T30 產(chǎn)孢量比野生型黑脛病菌株nm-1 明顯減少，而突變體T29 未產(chǎn)孢。突變體在培養(yǎng)過程中均有色素產(chǎn)生，且色素顏色與野生型黑脛病菌株nm-1 相近，但突變體T12 色素顏色偏紅褐色與野生型黑脛病菌株nm-1 明顯不同。

2.2 突變體菌株生長速度

突變體菌落生長速度測定結(jié)果如圖2a 所示。各突變體的生長速度與野生型黑脛病菌株nm-1 相比均有所下降。下降幅度最大的是突變體T32，其菌落直徑為6.67 cm，與野生型黑脛病菌株nm-1（8.07 cm）相比其菌落直徑下降了18.3%。其次菌落直徑下降較多的是突變體T8、T10、T17、T30，其菌落直徑分別為7.19、6.89、7.14、7.01 cm，與野生型黑脛病菌株nm-1 的菌落直徑相比分別下降了10.9%、14.6%、11.5%、13.1%。其余突變體菌株下降幅度較小，但仍與野生型黑脛病菌株nm-1 有顯著差異（P<0.05），其中突變體T4、T34 的菌落直徑均為7.83 cm，與野生型黑脛病菌株nm-1 的生長速度最接近。

2.3 突變體菌株產(chǎn)孢量測定

突變體的產(chǎn)孢量測定結(jié)果如圖2b 所示。檢測的26 個突變體中，96%的突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 相比產(chǎn)孢量顯著下降。野生型黑脛病菌株nm-1 的產(chǎn)孢量為3.84×106個/mL，其中下降最明顯的是突變體T9、T12、T14，產(chǎn)孢量分別為0.39×106、0.36×106、0.37×106個/mL，與野生型黑脛病菌株nm-1相比分別下降了89.8%、90%、90.3%。突變體T31和T34 產(chǎn)孢量分別為3.27×106、3.11×106個/mL，與野生型黑脛病菌株nm-1 最為接近，且差異不顯著（P>0.05），只有突變體T13 產(chǎn)孢量顯著高于nm-1，為8.9×106個/mL，與野生型黑脛病菌株nm-1 相比提高了56.8%。

2.4 突變體菌株致病性測定

突變體致病性測定結(jié)果如圖2c 所示。檢測的26 個突變體中，53%的突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 相比致病力無顯著差異（P>0.05），其中突變體T3、T12、T34、T36 與野生型黑脛病菌株nm-1病情指數(shù)最接近。7 個突變體（T17、T21、T27、T28、T30、T31、T32）病情指數(shù)與野生型黑脛病菌株nm-1相比顯著上升，其病情指數(shù)分別為83.33、80.00、70.00、87.50、83.06、67.50、83.05，與野生型黑脛病菌株nm-1相比分別提高87.2%、79.7%、53.8%、96.6%、86.6%、48.4%、86.6%。突變體T2、T16、T18 的病情指數(shù)有所上升，其病情指數(shù)與野生型黑脛病菌株nm-1 相比分別提高23.0%、16.1%、24.5%。突變體T11 的病情指數(shù)與野生型黑脛病菌株nm-1 相比顯著降低，其病情指數(shù)為29.54，與野生型黑脛病菌株nm-1 相比降低33.60%。

2.5 突變體菌株生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)間的相關性

對所測突變體和野生型菌株的生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)之間的相關性進行分析發(fā)現(xiàn)，生長速度與病情指數(shù)之間存在顯著負相關，生長速度與產(chǎn)孢量、產(chǎn)孢量與病情指數(shù)之間不存在顯著相關性（表1）。

2.6 突變體菌株胞外酶測定

表1 菌株生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)之間的相關性

突變體菌株胞外酶分泌測定結(jié)果如圖3 所示。突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 在添加脫脂奶粉和可溶性淀粉的查比克培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生透明圈（圖3a、圖3b），所測菌株在添加脫脂奶粉的查比克培養(yǎng)基上均未產(chǎn)生分生孢子，在添加可溶性淀粉的查比克培養(yǎng)基上菌絲生長稀疏且均未產(chǎn)生分生孢子，表明突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 都具有蛋白酶和淀粉酶分泌的能力，外源基因的插入對突變體蛋白酶和淀粉酶的合成與分泌無影響。突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 在添加果膠和纖維素的查比克培養(yǎng)基上均未產(chǎn)生透明圈（圖3c、圖3d），所測菌株在添加果膠的查比克培養(yǎng)基上菌絲正常生長但未產(chǎn)生分生孢子，在添加纖維素的查比克培養(yǎng)基上菌落生長異常，菌絲稀疏并且不產(chǎn)生分生孢子，表明突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 均無分泌果膠酶和纖維素酶的能力。含果膠的查比克培養(yǎng)基雖然適宜菌絲體生長，但不利于產(chǎn)孢。

3 討論與結(jié)論

通過農(nóng)桿菌介導真菌的遺傳轉(zhuǎn)化，不能確定T-DNA 外源基因插入的位置，也不能確定插入基因的穩(wěn)定性[13]，T-DNA 的插入位點不同可能對病原菌的一些性狀產(chǎn)生影響，有些可能與病原菌的生長和致病性相關。因此，需要從已獲得的黑脛病菌突變體中篩選出遺傳穩(wěn)定且生物學性狀和致病性都沒有發(fā)生顯著變化的突變體菌株侵染油菜。對突變體的菌落形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)多數(shù)突變體的菌落形態(tài)與野生型黑脛病菌株nm-1 相近，只有個別突變體在色素顏色和菌落生長狀態(tài)方面有較大變異。突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 在菌落生長速度和產(chǎn)孢量方面相比，多數(shù)突變體的生長速度和產(chǎn)孢量都顯著下降。蓋曉彤[14]在玉米莖腐病和稻腐病的研究中表明，禾谷鐮孢菌野生型菌株的產(chǎn)孢量均高于其相應突變體，而輪枝鐮孢菌野生型菌株的產(chǎn)孢量低于其突變體。說明對不同病原菌的突變體在產(chǎn)孢量方面表現(xiàn)不同。突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 相比，突變體的致病性并沒有因產(chǎn)孢量的下降而減弱，而多數(shù)突變體產(chǎn)孢量低于野生型黑脛病菌株nm-1，但多數(shù)突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 的致病力沒有顯著差異，甚至致病性更強一些，只有1 株致病力是減弱的，表明黑脛病菌的致病性與產(chǎn)孢量無明顯相關性。同時對突變體和野生型黑脛病菌株的生長速度、產(chǎn)孢量、病情指數(shù)進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)孢量與病情指數(shù)之間不存在顯著相關性，但生長速度與病情指數(shù)之間顯著負相關。而王曉楠[15]在研究棉花黃萎病時其突變體產(chǎn)微菌核能力降低，致病力也顯著下降，說明棉花黃萎病菌的致病力與微菌核的產(chǎn)生可能存在一定程度正相關性。但周芳芳等[16]在對棉花黃萎病菌突變體產(chǎn)孢量、生長速度、粗毒素、致病性之間相關性研究中發(fā)現(xiàn)四者之間不存在明顯的相關性，表明不同病原菌的突變體在致病性與表型沒有相關性。胞外酶在營養(yǎng)吸收、自我保護和入侵植物細胞等方面都有重要作用。長期以來，關于真菌胞外酶研究最多的是果膠酶和纖維素酶，除此之外，在病原菌侵染植物過程中產(chǎn)生的蛋白酶有助于病原菌穿過植物細胞壁，降解植物的相關防御蛋白[17]。本研究中獲得的突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 在含脫脂奶粉和可溶性淀粉的培養(yǎng)基上均可以正常生長并產(chǎn)生透明圈，說明突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 一樣，可以分泌蛋白酶和淀粉酶。突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 在含果膠和纖維素的培養(yǎng)基上不產(chǎn)生透明圈且不能正常生長，說明突變體與野生型黑脛病菌株nm-1 一樣，不能分泌果膠酶和纖維素酶。外源基因的插入不影響黑脛病菌突變體胞外酶的分泌，也沒有產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型突變體。而徐榮旗[18]在研究棉花黃萎病時發(fā)現(xiàn)，T-DNA 插入突變造成了約3%的營養(yǎng)缺陷型，說明T-DNA 的插入可能會導致某個合成或分解代謝基因功能的喪失，影響病原菌對某種營養(yǎng)物質(zhì)的分解利用及其生長，繼而可能影響其致病性。除添加纖維素的培養(yǎng)基外，突變體和野生型黑脛病菌株nm-1 在PDA 培養(yǎng)基上均可正常產(chǎn)孢，但在查比克培養(yǎng)基上均未產(chǎn)孢，這與郝麗芬[19]在研究不同碳源對黑脛病病原菌生長影響的結(jié)果相同。本研究最終獲得了與野生型黑脛病菌株表型相近的突變體，攜帶GFP 基因的突變體T34 可以作為野生型黑脛病菌株的替代菌株，示蹤菌株的侵染過程而進一步研究植物與病原菌的互作機制。