藥用植物離體培養(yǎng)技術的研究進展及其應用前景

鄺賢婷，譚 笑，陳思儀，劉淑霞，生書晶

（廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東廣州 510225）

我國藥用植物資源種類繁多，蘊藏量豐富。隨著藥用植物藥理研究的深入，其應用也越來越廣泛，日益受到世界醫(yī)療體系的認可。近年來，藥用植物資源的社會需求不斷增加，但是多數(shù)藥用植物人工栽培生長周期長、繁殖系數(shù)低，再加上藥用植物的藥效成分多為次生代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量低且易受環(huán)境氣候的影響，因此，很多藥用植物資源難以滿足社會需求。隨著生物學研究的發(fā)展，植物離體培養(yǎng)技術越來越成熟，以此來解決藥用植物的資源短缺問題，無疑具有重要的社會價值和現(xiàn)實意義。通過文獻查閱，結(jié)合筆者對何首烏等藥用植物的資源研究，概述了愈傷組織、細胞培養(yǎng)、不定根誘導以及毛狀根體系等植物離體培養(yǎng)技術在藥用植物資源保護和開發(fā)利用發(fā)面的研究。離體培養(yǎng)技術不但可以應用于藥用植物的快速繁殖，還可以應用于藥用植物有效成分的積累以及生物轉(zhuǎn)化合成新的化合物；通過離體培養(yǎng)技術對次生代謝產(chǎn)物的代謝途徑進行研究，可以從根源上提高次生代謝產(chǎn)物的含量，從而有助于緩解藥用植物的資源危機。

1 藥用植物離體培養(yǎng)技術的研究進展

1.1 愈傷組織

愈傷組織是植物細胞脫分化后形成的一種無定形狀態(tài)的薄壁細胞，可以在短時間內(nèi)分化形成幼苗，實現(xiàn)快速繁殖，從而克服藥用植物人工栽培周期長、生長緩慢的難題。據(jù)統(tǒng)計，進行愈傷組織培養(yǎng)研究過的藥用植物超過400 種[1]。人參自古被稱為“百草之王”，具有廣泛的藥理作用，早在20 世紀60年代，就已經(jīng)有了人參愈傷組織培養(yǎng)的報道[2]。但是由于人參愈傷組織生長較為緩慢，且其中的有效成分含量遠低于天然植株，至今人們還在探索和優(yōu)化人參愈傷誘導分化的條件，以便將其工業(yè)化生產(chǎn)。

1.2 細胞培養(yǎng)

植物細胞培養(yǎng)是指在細胞離開生命體的前提下，以單個細胞體或者若干個細胞體為單位進行懸浮培養(yǎng)[3]。植物細胞培養(yǎng)技術可以優(yōu)化最佳的培養(yǎng)條件，在較短時間內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)，從而緩解藥用植物資源供應的難題。從20 世紀80年代至今，藥用植物細胞培養(yǎng)一直是研究的熱點，并取得一系列成果，如在人參、西洋參、紫草、紅豆杉的研究上均取得了細胞懸浮培養(yǎng)的成功[4]。但是，由于植物細胞生長相對較慢，次生代謝產(chǎn)物的合成與積累需要一個漫長的過程，這個過程容易受到培養(yǎng)條件如傳質(zhì)、傳氧等的影響，導致在多次傳代后出現(xiàn)老化的現(xiàn)象，因此，對優(yōu)質(zhì)懸浮細胞系進行篩選和優(yōu)化仍是目前研究的重點[5-6]。另外，細胞培養(yǎng)工業(yè)化的前提是合適的細胞培養(yǎng)反應器的制備，如何解決在細胞生長高黏度的狀態(tài)下，以合適的剪切力攪拌，達到傳質(zhì)、傳氧等最合適的植物細胞生長環(huán)境，是植物細胞培養(yǎng)工業(yè)化亟須解決的問題。

1.3 不定根

不定根一般是在植物器官受傷或激素、病原微生物等外界因素刺激下由植物的莖或葉上長出的根[7]。目前對藥用植物不定根的研究還不太廣泛，主要集中于幾種以根莖入藥的名貴藥用植物，如丹參、三七、人參、柴胡、白術等。但是人參不定根中皂苷含量低，仍然是亟待解決的問題。其他藥用植物的不定根研究尚處于起步階段，如王梅等[7]通過向柴胡根離體培養(yǎng)體系中添加前體物質(zhì)、誘導子等，探討了不同處理對柴胡不定根合成柴胡皂苷的影響，建立了北柴胡不定根生產(chǎn)柴胡皂苷的離體培養(yǎng)體系。陳巍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度、培養(yǎng)基pH 值、接種量等外界培養(yǎng)條件顯著影響丹參不定根的生長及其次生代謝產(chǎn)物的合成。吳炯等[9]對白術試管苗不定根的誘導和離體培養(yǎng)進行了系統(tǒng)研究，并且發(fā)現(xiàn)不定根中含有與藥用植物白術根莖中相同的各類化學成分。

1.4 毛狀根

毛狀根又稱發(fā)根，是發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植株或某一器官組織而形成的。因毛狀根具有培養(yǎng)體系生長迅速、效率高、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點，已成為植物組織培養(yǎng)的研究熱點。目前，已有100 多種植物的毛狀根被成功誘導[10]，通過優(yōu)化培養(yǎng)基、光照、pH 值、溫度等物理因素以及添加外源激素、誘導子等化學因子，有些毛狀根中的次生代謝產(chǎn)物含量甚至會超過原植株含量，具有重要的應用價值。陳觀水等[11]建立了太子參毛狀根的培養(yǎng)體系，為利用毛狀根大規(guī)模生產(chǎn)藥用有效成分奠定了基礎。人參、三七、丹參、黃芪、當歸、銀杏等藥用植物的毛狀根利用也已經(jīng)獲得成功[12]。其中，人參毛狀根已經(jīng)實現(xiàn)了商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，且其產(chǎn)品大規(guī)模應用于制藥、食品和化妝品行業(yè)[13]。但是，大部分藥用植物毛狀根體系的研究仍處在研究階段，這是由于毛狀根經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)后會退化，其次生代謝產(chǎn)物的含量降低，因此，毛狀根體系的優(yōu)化和篩選仍然是目前研究的主要內(nèi)容。

2 藥用植物離體培養(yǎng)技術的應用

2.1 藥用植物快速繁殖

由于人工栽培的藥用植物大多生長周期較長，而市場對名貴中藥材的需求日益增加，使得藥用植物資源過度開發(fā)，一些珍惜藥用植物瀕臨滅絕。例如早些年我國蘊藏量豐富的野生甘草已經(jīng)滅絕[14]。其他名貴中藥材如金花茶、人參和紅豆杉已被列入國家一級保護野生植物名錄，長此以往，將對傳統(tǒng)醫(yī)學造成沖擊。利用離體培養(yǎng)技術分化成植株，可以實現(xiàn)藥用植物的快速繁殖，從而解決瀕危藥用植物的資源問題。藏紅花引種我國以來，多采用分球繁殖的方式，繁殖系數(shù)低、種球易受病毒侵害且易退化，限制了藏紅花的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化種植[15]。針對該問題，經(jīng)過多年的摸索，目前已經(jīng)建立了藏紅花花柱誘導愈傷組織的初代培養(yǎng)技術體系。據(jù)統(tǒng)計，目前已有200 多種藥用植物經(jīng)過離體培養(yǎng)成功獲得了試管植株，實現(xiàn)了快速繁殖，其中絕大多數(shù)為珍貴稀有的藥用植物[2]，如人參、鐵皮石斛、金線蓮等。

2.2 利用藥用植物離體培養(yǎng)技術生產(chǎn)藥用植物活性化合物

藥用植物的活性產(chǎn)物往往是其次生代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低，利用離體培養(yǎng)技術生產(chǎn)藥用植物活性成分具有重要的經(jīng)濟效益和社會效益。據(jù)統(tǒng)計，近1 000 種藥用植物的離體培養(yǎng)技術獲得成功，提供了超過600 種的活性成分，并且人參、紫杉醇、青蒿素的離體培養(yǎng)生產(chǎn)已經(jīng)達到了工業(yè)化水平[1]。王娟等[16]綜述了藥用植物中次生代謝產(chǎn)物的積累，多種次生代謝產(chǎn)物如萜類、黃酮類、生物堿、蒽醌類、酚酸以及類固醇等都通過不同的離體培養(yǎng)技術得到生產(chǎn)，如可以用烏拉爾甘草懸浮細胞來積累黃酮類產(chǎn)物[17]、迷迭香懸浮細胞積累迷迭香酸[18]、雷公藤固定化離體細胞積累雷公藤甲素[19]、野葛細胞積累黃酮類[20]、銀杏懸浮或者固定化細胞積累黃酮類和銀杏內(nèi)酯等[21]。研究發(fā)現(xiàn)，通過改變培養(yǎng)條件，如調(diào)整培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分含量、調(diào)整pH 值和溫度、添加外源激素、進行菌體感染等生物刺激，均能有效提高離體培養(yǎng)材料中活性成分的含量，這些研究為藥用植物中次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)提供了有效的途徑。

2.3 利用藥用植物離體培養(yǎng)技術進行生物轉(zhuǎn)化合成

生物體系中會存在各種各樣的酶，而這些酶系統(tǒng)能夠?qū)ν庠葱缘孜镞M行糖基化、羥基化、甲基化、氧化、還原等結(jié)構修飾，即為生物轉(zhuǎn)化。由于多酶催化作用的不確定性，還可能產(chǎn)生一些新的活性物質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計，迄今已有超過40 種的植物細胞成功進行了生物轉(zhuǎn)化[22]，其中懸浮細胞和毛狀根體系應用較多。LIU 等[23]使用長春花懸浮細胞，將外源底物脫氫表雄酮轉(zhuǎn)化成了13 個新的化合物。西洋參冠癭組織細胞在添加丹皮酚和大黃素后，可以合成多種糖基化、羥基化和甲基化的活性衍生物[24]。韓健等[25]利用長春花及銀杏植物細胞懸浮培養(yǎng)細胞分別成功地將青蒿素進行轉(zhuǎn)化。由于懸浮培養(yǎng)細胞具有體細胞克隆不穩(wěn)定的缺陷，長期生產(chǎn)會導致細胞活性降低，所以為了維持高產(chǎn)必須對細胞株進行不斷篩選。毛狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也已經(jīng)廣泛應用于藥物活性成分的生物轉(zhuǎn)化研究。目前已有人參、西洋參、何首烏、長春花、紅景天、石斛等藥用植物進行毛狀根生物轉(zhuǎn)化的報道，如人參毛狀根成功將毛地黃毒苷配基轉(zhuǎn)化成5 種酯化產(chǎn)物以及6 種糖苷化產(chǎn)物[26]，何首烏毛狀根體系可以轉(zhuǎn)化青蒿素類、倍半萜類、瑞香素等一系列化合物[20]。離體培養(yǎng)技術在生物轉(zhuǎn)化方面有著廣闊的發(fā)展前景，對于充實新化合物資源，甚至研制開發(fā)新藥都是一個可行的方法，值得進一步研究挖掘。

2.4 藥用植物離體培養(yǎng)技術在次生代謝工程方面的研究

藥用植物次生代謝工程是利用基因工程的手段對次生代謝途徑進行修飾、調(diào)控甚至改變，以期提高次生代謝產(chǎn)物的含量。目前，雖然多數(shù)藥用植物的次生代謝途徑還未完全闡釋清楚，但次生代謝途徑中關鍵酶基因已有很多報道。LEE 等[27]、SHIBATA[28]構建了人參氧化鯊烯合成酶的超表達載體，轉(zhuǎn)化人參毛狀根后，其中所含的三萜皂苷比對照組明顯提高；除了超表達研究，對人參皂苷合成的支路途經(jīng)進行干擾，也能提高目的皂苷的含量。筆者前期研究表明，芪合酶是何首烏二苯乙烯苷合成途徑的關鍵酶，將含有芪合酶基因的過表達載體和RNA 干擾載體導入野生型發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834 中，轉(zhuǎn)化何首烏外植體誘導生成毛狀根，結(jié)果表明，芪合酶過表達的何首烏毛狀根中二苯乙烯苷含量是空白組的2.41 倍，而RNA 干擾組二苯乙烯苷合成明顯減少[29]。

3 展望

藥用植物離體培養(yǎng)技術日益提高，無疑成為解決藥用植物資源短缺的有效手段。目前，除了人參細胞培養(yǎng)有工業(yè)化的報道以外，多數(shù)藥用植物的離體培養(yǎng)還在實驗室階段。所以對離體培養(yǎng)的細胞進行優(yōu)化和篩選，對離體培養(yǎng)條件甚至培養(yǎng)反應器進行優(yōu)化設計，解決植物細胞傳代后的老化問題，是藥用植物離體培養(yǎng)工業(yè)化的前提條件。離體培養(yǎng)技術在藥用植物的快速繁殖和有效成分的積累方面無疑具有明顯的優(yōu)勢。通過離體培養(yǎng)技術對次生代謝產(chǎn)物的代謝途徑進行研究，將可以通過基因調(diào)控的手段，從根源上提高次生代謝產(chǎn)物的含量，成為解決藥用植物資源危機的有效手段，也為開拓藥用植物的應用領域提供了廣闊的前景。