苯磺隆對兩株木霉的毒力測定

郎劍鋒,陸寧海,趙榮艷,石明旺

（河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

木霉是土壤微生物區(qū)系的重要組成部分,由于其具有生長和繁殖快、對人畜安全[1],可對多種植物病原菌具有拮抗活性[2]而受到人們的廣泛關(guān)注.目前市面上已有多種木霉菌劑問世,多為活的孢子菌劑,但由于其對環(huán)境條件變化敏感而限制了推廣和應(yīng)用,尤其是化學(xué)藥劑對其的影響更受關(guān)注.國內(nèi)外多名學(xué)者研究了不同化學(xué)藥劑（包括化學(xué)農(nóng)藥、肥料[3]及重金屬離子[4]等）對木霉生長的影響.陳建愛等[5]發(fā)現(xiàn)不同生態(tài)環(huán)境對木霉生存影響很大,有農(nóng)藥、化肥污染的土壤中木霉的菌量少.Santoro 等[6]研究發(fā)現(xiàn)異惡草酮、2,4-D 和咪唑煙酸對深綠木霉具有最小的毒性,可以與木霉共同使用.程東美等[7]研究了5 種常見的土壤除草劑對哈茨木霉T2 菌株的影響,發(fā)現(xiàn)芐·甲磺隆對哈茨木霉的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有強烈的抑制作用,氟樂靈也有較強的抑制作用,結(jié)果表明莠去津可以與哈茨木霉同時使用或混用,芐·甲磺隆使用后短期內(nèi)不應(yīng)使用木霉.郎劍鋒等[8]研究了8 種常見的除草劑對哈茨木霉的影響,結(jié)果表明哈茨木霉在田間施用時,應(yīng)避開與木霉的共同使用.成元剛等[9]研究了6 種除草劑對哈茨木霉的影響,發(fā)現(xiàn)苯磺隆或百草枯對木霉影響較小.前面所述研究采用的大多為高營養(yǎng)的PDA 培養(yǎng)基,而在低營養(yǎng)培養(yǎng)基下環(huán)境條件對木霉的影響如何,目前報道較少,而木霉在田間施放,卻是處在一個低營養(yǎng)的環(huán)境中.因此本研究選用土壤浸漬液培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以苯磺隆為供試農(nóng)藥,以擬康木霉菌株St-zn-9 和St-zn-9r作為供試菌株,采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法,研究大田常用除草劑苯磺隆對木霉菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響,旨在評估苯磺隆對木霉的毒力大小,為今后木霉菌劑的開發(fā)和田間應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試擬康木霉（Trichoderma pseudokoningii）菌株St-zn-9 和St-zn-9r由河南科技學(xué)院植物病理實驗室提供,其中菌株St-zn-9r為木霉菌株St-zn-9 經(jīng)紫外誘變后對腐霉利有抗性的菌株.

1.1.2 供試農(nóng)藥10%苯磺隆可濕性粉劑,濰坊卓爾農(nóng)化有限公司.

1.1.3 培養(yǎng)基 供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基選用改良的土壤浸漬液固體培養(yǎng)基,配方為：土壤200 g,秸稈200 g,瓊脂15 g,水1 000 mL,pH 自然.土壤采自河南科技學(xué)院小麥試驗田耕作層土壤,土壤類型為壤土,秸稈為小麥秸稈.配制方法為：土壤及秸稈煮沸30 min 后,靜置,過濾取上清液,加入瓊脂,121 ℃滅菌30 min 后備用.

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)溫度選擇 選擇在木霉生長最好的28 ℃下進行試驗.

1.2.2 苯磺隆對木霉菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 采用含毒介質(zhì)培養(yǎng)法[10],將苯磺隆加入到培養(yǎng)基中,根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,使培養(yǎng)基中苯磺隆質(zhì)量濃度分別達到600、1 000、2 000、3 500、5 000 和6 500 mg/L 的含藥培養(yǎng)基,然后將活化好的木霉菌種菌餅（d=5 mm）放置于固體平板中央,于恒溫箱中28 ℃培養(yǎng)72 h 后,采用十字交叉法測量菌落直徑,計算抑制率.待對照菌落完成變綠后,用血球計算板測量木霉產(chǎn)孢量,計算產(chǎn)孢抑制率.以未含藥培養(yǎng)基的木霉生長情況作為對照.

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 以質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標, 菌落直徑生長抑制率轉(zhuǎn)化的機率值作為縱坐標, 通過Excel 2010 求毒力回歸方程y=a+bx,相關(guān)系數(shù)R2,抑制中質(zhì)量濃度EC50.把抑制率轉(zhuǎn)化為反正弦后利用SPSS 16.0 軟件對數(shù)據(jù)進行Ducan 氏新復(fù)極差法多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 對兩株木霉菌絲生長的影響

不同質(zhì)量濃度苯磺隆對木霉菌絲生長的影響結(jié)果見表1.

表1 不同質(zhì)量濃度苯磺隆對木霉菌絲生長的影響Tab.1 Effects of Bensulfuron-methyl at different concentrations on the hyphae growth of Trichoderma

由表1 可知,不同質(zhì)量濃度的苯磺隆對兩個木霉菌株均具有抑制作用.在低質(zhì)量濃度（600 mg/L）時抑制率均小于10%,隨著質(zhì)量濃度的增加,抑制率隨之增加.不同質(zhì)量濃度之間均達到極顯著差異.從菌落直徑來看,St-zn-9 的菌落直徑明顯小于St-zn-9r,說明St-zn-9r在土壤中具有更好的生存能力,苯磺隆對木霉的抑制率St-zn-9r在各個質(zhì)量濃度均小于St-zn-9,說明St-zn-9r對苯磺隆具有更高的抗性.

以質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標,以幾率值作為縱坐標可得到兩個菌株的毒力回歸方程（見表2）.據(jù)毒力回歸方程計算出苯磺隆對木霉St-zn-9 和St-zn-9r的EC50分別為2 836.432 5 mg/L 和3 650.561 1 mg/L,進一步說明突變菌株St-zn-9r對苯磺隆具有較高的抗性.

表2 苯磺隆對木霉菌株的毒力分析Tab.2 Toxicity analysis of bensulfuron-methyl to Trichoderma strains

2.2 對兩株木霉產(chǎn)孢量的影響

不同質(zhì)量濃度苯磺隆對木霉產(chǎn)孢量的影響結(jié)果見表3.

表3 不同質(zhì)量濃度苯磺隆對木霉產(chǎn)孢量的影響Tab.3 Effects of Bensulfuron-methyl at Different Concentrations on sporulation of Trichoderma

由表3 可知,苯磺隆對兩株木霉均有較強的抑制能力.其在低質(zhì)量濃度（600 mg/L）下對兩株木霉產(chǎn)孢量的抑制率均超過了40%.且隨著質(zhì)量濃度的增加對產(chǎn)孢量的抑制能力也在增加.

3 結(jié)論與討論

土壤微生物作為土壤健康的指示劑[11],化學(xué)農(nóng)藥對土壤微生物的生長具有負面或正面的影響.如龔明等[12]發(fā)現(xiàn)甲胺磷對土壤微生物總量不會有顯著變化,但會使真菌豐度下降和細菌種群上升而達到一種動態(tài)平衡.孫淑清等[13]發(fā)現(xiàn)不同微生物對除草劑的敏感性存在差異.長期大量使用化學(xué)藥劑,易造成農(nóng)藥殘留,有害生物再猖獗和抗藥性,通過使用微生物農(nóng)藥,代替或部分代替化學(xué)藥劑,可降低田間化學(xué)藥劑噴灑數(shù)量,但微生物農(nóng)藥使用過程中會受到化學(xué)藥劑的影響.微生物農(nóng)藥和生防菌劑協(xié)同控制植物病害成為熱點之一[14-15].苯磺隆主要用于防治一年生闊葉雜草,施放到土壤中對土壤真菌具有強烈的抑制作用[16].木霉作為一種土壤微生物中的重要種群,研究苯磺隆對其毒性大小具有重要意義.

本研究結(jié)果表明,不同質(zhì)量濃度的苯磺隆對木霉菌絲生長和產(chǎn)孢量均有抑制作用.對菌絲生長的毒力回歸分析表明,苯磺隆對兩種菌株的毒力不同,EC50分別為2 836.432 6 mg/L 和3 650.561 1 mg/L,突變菌株St-zn-9r對苯磺隆具有更高的抗性.楊正軍等[17]以《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》作為參考,將農(nóng)藥對木霉的毒性劃為四個等級,其中當EC50≥200 mg/L 時為低毒,本試驗中苯磺隆對兩株木霉菌絲生長的EC50已經(jīng)遠遠大于該參考標準.而且苯磺隆在田間使用的推薦質(zhì)量濃度為400～600 mg/L,本試驗中在600 mg/L 時苯磺隆對木霉的抑制率在6.00%和8.30%,如僅考慮菌絲生長的話,苯磺隆對木霉的抑制能力并不高.但苯磺隆對木霉產(chǎn)孢量的研究中,在低質(zhì)量濃度（600 mg/L）時苯磺隆對兩株木霉產(chǎn)孢的抑制率就均達到了40%,且隨苯磺隆質(zhì)量濃度升高抑制率升高,在高質(zhì)量濃度（6 500 mg/L）時,對St-zn-9產(chǎn)孢量的抑制率達到了94.99%,對St-zn-9r的抑制率也達到了78.90%.因此,綜合考慮苯磺隆對木霉菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響,建議在田間使用苯磺隆時,應(yīng)避開與木霉的同時施放.

成元剛等[9]對苯磺隆對木霉菌絲生長和產(chǎn)孢量的研究中,得出苯磺隆的EC50為13 556.342 mg/L,而本試驗中苯磺隆對木霉St-zn-9 和St-zn-9r的EC50分別為2 836.432 6 mg/L 和3 650.561 1 mg/L,只是相當于其EC50的20.93%和26.93%.分析可能是由于供試菌株和培養(yǎng)基的不同導(dǎo)致.不同的菌株對農(nóng)藥的抗性是不同的[18],而在高營養(yǎng)培養(yǎng)基和低營養(yǎng)培養(yǎng)基上農(nóng)藥對其的抑制能力也是不同的,在低營養(yǎng)的培養(yǎng)基上化學(xué)藥劑對其有更高的毒性[3].本試驗所采用的改良的土壤浸漬液培養(yǎng)基,更接近于大田實際,所得結(jié)果有利于指導(dǎo)今后的農(nóng)業(yè)生產(chǎn).

目前利用誘變產(chǎn)生對農(nóng)藥有抗性的菌株多有報導(dǎo)[19,20].本研究所選的木霉St-zn-9r菌株,為原始菌株St-zn-9 經(jīng)紫外誘變后對腐霉利有抗性的菌株,結(jié)果也表明,該誘變菌株較原始菌株對苯磺隆同樣具有更高的抗性,說明紫外誘變后木霉對苯磺隆產(chǎn)生交互抗性.分析可能是由于經(jīng)誘變后木霉某些基因被誘導(dǎo)使其更耐受農(nóng)藥而具有更好的競爭力,甚至有可能成為農(nóng)藥降解菌,而木霉也是目前研究較多的農(nóng)藥降解菌之一[21-22].