JAK2信號通路介導(dǎo)人惡性黑素瘤A375細(xì)胞的自噬和凋亡機(jī)制研究

[摘要]目的：探討JAK2/STAT3信號通路介導(dǎo)人惡性黑素瘤A375細(xì)胞的自噬和凋亡活性，為黑素瘤的發(fā)生機(jī)制和潛在干預(yù)靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。方法：人惡性黑素瘤A375細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇和傳代后隨機(jī)分為對照組和JAK2抑制劑干預(yù)組，比較兩組細(xì)胞培養(yǎng)12h、24h、48h和72h的增殖率（采用MTT定量法）及凋亡率（采用流式細(xì)胞術(shù)），培養(yǎng)72h的細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3、LC3B和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量（采用Western blot法），檢測IL-6和TNF-α水平（采用ELISA法），檢測Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量[采用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法]。結(jié)果：兩組培養(yǎng)12h、24h、48h和72h的細(xì)胞增殖率比較，干預(yù)組各時間點(diǎn)均明顯小于對照組，而凋亡率明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。干預(yù)組培養(yǎng)72h的細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量、IL-6和TNF-α水平明顯低于對照組，但LC3B蛋白、Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：JAK2/STAT3信號通路異常激活可能是人黑素瘤A375細(xì)胞惡性增殖的重要通路之一，靶向干預(yù)JAK2/STAT3信號通路可以促進(jìn)細(xì)胞自噬和凋亡活性上調(diào)，有望成為臨床干預(yù)的重要靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]JAK2/STAT3信號通路;黑素瘤;自噬;凋亡;增殖

[中圖分類號]R739.5? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）04-0098-04

Abstract： Objective? To study the autophagy and apoptotic activity of human malignant melanoma A375 cells via by JAK2/STAT3 signaling pathway，and provide theoretical basis for pathogenesis of melanoma and potential intervention target. Methods? After recovery and generation，human malignant melanoma A375 cells were randomly divided into the control group and the JAK2 inhibitor intervention group. MTT and flow cytometry were used to detect proliferation and apoptosis rates of cells after cultured for 12， 24， 48 and 72 hours， Western blot was used to detect relative expressions of JAK2， p-JAK2， STAT3， LC3B and p-STAT3 proteins， ELISA was used to detect levels of IL-6 and TNF-α and reverse transcription PCR （RT-PCR） was used to detect relative expressions of Caspase-3 and Bax/Bcl-2 mRNAs. Results? The cell proliferation rate of the intervention group was significantly lower than those of the control group at 12h， 24h， 48h and 72h， while the apoptosis rate was significantly higher than those of the control group， the differences were statistically significant（P<0.05）. Whats more， relative expressions of p-JAK2 and p-STAT3 proteins， IL-6 and TNF-α levels after 72h in the intervention group were both significantly lower than those of the control group， while expressions of LC3B protein， relative expressions of Caspase-3 and Bax/Bcl-2 mRNAs in the intervention group were all significantly higher than those of the control group（P<0.05）. Conclusion? Abnormal activation of JAK2/STAT3 signaling pathway may be one of important pathways for malignant proliferation in human melanoma A375 cells. Targeted intervention of JAK2/STAT3 signaling pathway can promote up-regulations of autophagy and apoptotic activities of cells， which is expected to become an important target for clinical intervention.

Key words： JAK2/STAT3 signaling pathway; melanoma; autophagy; apoptosis; proliferation

黑素瘤是最常見的皮膚和黏膜惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率明顯增多，已引起臨床的高度重視，早期以手術(shù)切除為主，中晚期以化療和靶向干預(yù)為主[1]。黑素瘤的發(fā)生與環(huán)境變化和基因突變有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)[2]，細(xì)胞惡性增殖、自噬和凋亡活性下降是黑色素瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。細(xì)胞自噬和凋亡是細(xì)胞存活、分化和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持的重要方式，受體內(nèi)外多個基因和信號通路的共同調(diào)控，具有較強(qiáng)的程序控制性[3]。JAK2/STAT3信號通路是真核生物體內(nèi)參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子表達(dá)等重要細(xì)胞內(nèi)途徑之一[4]。IL-6和TNF-α是JAK2/STAT3信號通路的重要誘導(dǎo)劑，在多種惡性腫瘤如結(jié)直腸癌、黑素瘤、胃癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。JAK2/STAT3信號通路的活化既需要炎癥因子IL-6和TNF-α的誘導(dǎo)，同時又可加劇炎癥因子的釋放，形成炎癥瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，參與惡性腫瘤的凋亡和自噬過程。并且，腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、自噬和凋亡活性之間存在密切聯(lián)系，增殖活性增強(qiáng)提示腫瘤惡性程度較高，越早發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移;自噬和凋亡是細(xì)胞完成自我更新的兩種方式，兩者間可相互影響?；诖耍撗芯康闹饕康氖欠治鼋閷?dǎo)JAK2/STAT3信號通路激活參與人惡性黑素瘤A375細(xì)胞自噬和凋亡程度，為黑素瘤的發(fā)生機(jī)制和潛在干預(yù)靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1? 資料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人惡性黑素瘤A375細(xì)胞購自上海生工科技有限公司，經(jīng)常規(guī)復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)，采用DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清配成完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中每3d進(jìn)行半量或全量換液。待細(xì)胞融合度達(dá)80%，以0.25%胰酶消化，進(jìn)行1：2比例傳代培養(yǎng)，PBS重懸細(xì)胞濃度為1×106/ml進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 研究方法：實(shí)驗(yàn)分為對照組和JAK2抑制劑干預(yù)組，對照組采用人惡性黑素瘤A375細(xì)胞正常培養(yǎng)，干預(yù)組采用JAK2抑制劑AG-490 3ml與A375細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)。比較兩組細(xì)胞培養(yǎng)12h、24h、48h和72h的增殖率及凋亡率，培養(yǎng)72h的細(xì)胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量采用Western blot法，ELISA法檢測IL-6和TNF-α水平，免疫熒光標(biāo)記法檢測微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）陽性率，反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）法檢測Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量。

1.3 檢測方法

1.3.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖率：將各組細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞濃度調(diào)整為5×103個/孔，分別培養(yǎng)12h、24h、48h和72h，每個時間點(diǎn)設(shè)置3個復(fù)孔，結(jié)果取平均值作為最終結(jié)果。每孔加入40μl MTT溶液（美國Sigma公司）于37℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，棄上清，然后加入150μl DMSO溶液（美國Sigma公司）搖動10min，置于酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）上檢測490nm波長的吸光度（OD值），以630nm為參考波長。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：將兩組黑素瘤細(xì)胞和培養(yǎng)液根據(jù)分組要求進(jìn)行培養(yǎng)，分別于12h、24h、48h和72h收集細(xì)胞反應(yīng)液并進(jìn)行離心、PBS液沖洗，然后加入熒光標(biāo)記的共軛膜聯(lián)蛋白及碘化丙啶（美國Sigma公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測細(xì)胞凋亡率。凋亡試劑盒由美國R&D公司提供。

1.3.3 Western blot法檢測JAK2/STAT3、LC3B蛋白：兩組黑色素瘤細(xì)胞和不同培養(yǎng)液共培養(yǎng)72h，然后離心、PBS液沖洗，超聲碎解細(xì)胞后根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒（美國Sigma公司）提示提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行濃度和純度測定;去除培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30min，40℃ 1 500r/min離心5min，吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10μl待測。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，封閉液封閉1h，逐次兔抗人JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（LC3B，含LC3Ⅱ、LC3Ⅰ雙條帶）和內(nèi)參β-actin一抗（1：2 000，美國sigma公司）、羊抗兔對應(yīng)二抗（1：500，美國sigma公司）。PBS洗滌、ECL顯色、凝膠成像軟件行半定量分析，結(jié)果以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的條帶灰度比值表示。

1.3.4 ELISA法檢測IL-6和TNF-α：收集兩組培養(yǎng)72h的細(xì)胞，3 000r/min離心15～20min，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定IL-6及TNF-α水平。試劑盒由美國DSL公司提供，嚴(yán)格按說明書步驟進(jìn)行。

1.3.5 RT-PCR法檢測Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNAs：利用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，將合格的總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上海生工有限公司根據(jù)Gene Bank序列合成目標(biāo)引物序列（見表1），配置反應(yīng)體系包括cDNA 2μl+上下引物各3μl+Taq聚合酶0.5μl，加入無菌反應(yīng)水至總體積25μl，參照PCR擴(kuò)增參數(shù)要求設(shè)置為95℃ 5min預(yù)擴(kuò)增，（95℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 60s）共30個循環(huán)擴(kuò)增，72℃ 10min結(jié)束擴(kuò)增。收集電泳產(chǎn)物并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以目標(biāo)引物與內(nèi)參引物的條帶灰度比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對計量資料作t檢驗(yàn)，不同培養(yǎng)時間的細(xì)胞增殖率和凋亡率采用重復(fù)測量方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖率比較：干預(yù)組培養(yǎng)12h、24h、48h和72h的細(xì)胞增殖率（26.4±8.2，31.5±7.9，58.9±10.5，70.8±12.7）%均明顯小于對照組（30.8±6.7，49.9±11.4，72.4±14.7，92.5±13.7）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 兩組細(xì)胞凋亡率比較：干預(yù)組培養(yǎng)12h、24h、48h和72h的細(xì)胞凋亡率明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 兩組JAK2/STAT3蛋白相對表達(dá)量比較：干預(yù)組培養(yǎng)72h的細(xì)胞p-JAK2和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）; 但兩組JAK2和STAT3蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4 兩組細(xì)胞IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較：對照組培養(yǎng)72h的細(xì)胞IL-6和TNF-α表達(dá)水平明顯高于干預(yù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.5 兩組細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)情況：干預(yù)組培養(yǎng)72h的細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

2.6 兩組細(xì)胞Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNAs相對表達(dá)量比較：干預(yù)組培養(yǎng)72h的細(xì)胞Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNAs相對表達(dá)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3? 討論

惡性黑素瘤是一種由黑素細(xì)胞演變而來的高度惡性腫瘤，細(xì)胞自噬和凋亡活性下降是參與黑色素瘤惡性生物學(xué)行為表達(dá)的重要機(jī)制之一。細(xì)胞自噬和凋亡是真核生物體內(nèi)細(xì)胞存活、分化和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要方式，受體內(nèi)外多個基因和信號通路的共同調(diào)控，具有較強(qiáng)的程序控制性。目前，JAK2/STAT3信號通路已證實(shí)在免疫反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮十分重要的作用[5]。生理狀態(tài)下，JAK2/STAT3大多數(shù)處于非磷酸化水平，當(dāng)機(jī)體受外界刺激時可發(fā)生瞬時、快速的磷酸化轉(zhuǎn)化，持續(xù)時間較短，約6～12h，然后快速消失[6]。JAK2/STAT3通路通過胞內(nèi)段的酪氨酸蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)，與相應(yīng)受體如IL-6、TNF-α等結(jié)合，激活下游各種靶蛋白的酪氨酸殘基，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[7]。IL-6和TNF-α是JAK2/STAT3信號通路的重要誘導(dǎo)劑，在多種惡性腫瘤如結(jié)直腸癌、黑素瘤、胃癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，JAK2抑制劑干預(yù)人惡性黑素瘤A375細(xì)胞后，各培養(yǎng)時間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率較對照組明顯下降，而凋亡率則明顯升高，提示JAK2/STAT3信號通路是參與黑色素瘤惡性增殖的重要途經(jīng)之一，而JAK2是靶向干預(yù)該信號通路的重要節(jié)點(diǎn)[10]。STAT是JAK激酶的重要底物，STAT活化后通過多聚體結(jié)合形式存在并穿過核膜與特異性DNA反應(yīng)元件結(jié)合，啟動下游目的基因的轉(zhuǎn)錄，促使細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等功能[11]。研究證實(shí)，STAT3具有雙向調(diào)節(jié)功能，在不同的惡性腫瘤中可能發(fā)揮不同甚至相關(guān)的激活效應(yīng)，在黑素瘤細(xì)胞中通過阻斷JAK2/STAT3通路可明顯降低p-JAK2和p-STAT3蛋白的相對表達(dá)量，而對總蛋白JAK2和STAT3影響較小。提示磷酸化狀態(tài)的JAK2/STAT3對影響黑色素瘤的惡性增殖活性具有更加重要的作用[12-13]。

JAK2/STAT3信號通路的活化既需要炎癥因子IL-6和TNF-α的誘導(dǎo)，同時又可加劇炎癥因子的釋放，形成炎癥瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，參與惡性腫瘤的凋亡和自噬過程[14]。本研究結(jié)果提示，對照組培養(yǎng)72h的細(xì)胞IL-6和TNF-α水平高于干預(yù)組，干預(yù)組LC3B蛋白、Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量均明顯高于對照組。關(guān)于細(xì)胞自噬機(jī)制和活性分子研究最多的是LC3蛋白、Atgl2與Atg5復(fù)合體等形成，其中LC3Ⅰ和LC3Ⅱ主要參與自噬體的形成，LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3Ⅱ，主要定位于自噬體膜上，其含量與自噬體數(shù)目成正相關(guān)[15-16]。自噬和凋亡是細(xì)胞完成自我更新的兩種方式，兩者間可相互影響。細(xì)胞凋亡是一種精密調(diào)節(jié)的程序化細(xì)胞死亡過程，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在多條調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號通路，如線粒體依賴或非線粒體依賴途徑，Caspase家族是決定細(xì)胞凋亡方向和活性的最終通路[17-18]。凋亡的實(shí)現(xiàn)是通過一系列蛋白酶級聯(lián)式激活和切割的過程，其中Caspase-3被稱為死亡蛋白酶，主要發(fā)揮對蛋白激酶、核酸酶及細(xì)胞骨架的裂解，產(chǎn)生核皺縮、DNA片段等，最終控制凋亡的發(fā)生和發(fā)展[19]。Bax/Bcl-2比值可影響細(xì)胞的凋亡方向和程度，當(dāng)抗凋亡分子Bcl-2/促凋亡分子Bax≥50%時，細(xì)胞表現(xiàn)明顯的抗凋亡效應(yīng)[20]。

綜上所述，JAK2/STAT3信號通路異常激活可能是人黑素瘤A375細(xì)胞惡性增殖的重要通路之一，靶向干預(yù)JAK2/STAT3信號通路可以促進(jìn)細(xì)胞自噬和凋亡活性上調(diào)，有望成為臨床干預(yù)的重要靶點(diǎn)。

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[收稿日期]2019-11-28

本文引用格式：余揚(yáng).JAK2信號通路介導(dǎo)人惡性黑素瘤A375細(xì)胞的自噬和凋亡機(jī)制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2020，29（4）：98-101.