肺癌組織中胱硫醚-γ-裂解酶的表達及其臨床意義

尹輝 王倫青 喻本桐

摘要：目的 ?探討內源性硫化氫合成酶胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）在肺癌組織的表達及其臨床意義。方法 ?選取2008年12月～2013年12月青島大學附屬青島市市立醫(yī)院經(jīng)根治性肺葉手術切除并經(jīng)醫(yī)院病理科病理證實的肺癌患者125例，選取患者肺癌組織及癌旁正常組織各125例。應用免疫組化方法檢測胱硫醚-γ-裂解酶在肺癌組織及癌旁正常組織中的表達情況，分析CSE表達與肺癌患者臨床病理特征以及臨床預后的關系。結果 ?CSE在肺癌組織中高表達占79.20%，高于癌旁正常組織的16.00%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;CSE的表達情況與肺癌患者TNM分期、周圍淋巴結發(fā)生轉移與否、腫瘤大小、腫瘤分化程度有關（P<0.05）;CSE低表達肺癌患者5年生存率高于CSE高表達肺癌患者，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 ?CSE在肺癌組織中呈高表達，CSE的表達與肺癌患者TNM分期、周圍淋巴結發(fā)生轉移與否、腫瘤大小、腫瘤分化程度有關，CSE表達水平會對患者5年生存率造成影響，以CSE為靶點的研究思路可作為評估肺癌早期發(fā)生及預后的參考指標。

關鍵詞：胱硫醚-γ-裂解酶;肺癌;免疫組織化學

中圖分類號：R734.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.06.024

文章編號：1006-1959（2020）06-0083-04

Abstract：Objective ?To investigate the expression of endogenous hydrogen sulfide synthase cystathionine-γ-lyase （CSE） in lung cancer tissues and its clinical significance. Methods ?From December 2008 to December 2013， 125 patients with lung cancer who underwent radical lung lobe resection and pathologically confirmed by the pathology department of the Qingdao Municipal Hospital affiliated to Qingdao University were selected， and 125 patients with lung cancer tissues and adjacent normal tissues were selected. Immunohistochemical method was used to detect the expression of cystathionine-γ-lyase in lung cancer tissues and adjacent normal tissues， and the relationship between CSE expression and clinical pathological characteristics and clinical prognosis of lung cancer patients was analyzed. Results ?The high expression of CSE in lung cancer tissues accounts for 79.20%， which is higher than 16.00% of normal tissues adjacent to the cancer，the difference is statistically significant （P<0.05）; the expression of CSE is related to the TNM stage of lung cancer patients， the occurrence of peripheral lymph nodes or not， and tumor size the degree of tumor differentiation was related （P<0.05）.The 5-year survival rate of patients with low CSE lung cancer was higher than that of patients with high CSE lung cancer，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion ?CSE is highly expressed in lung cancer tissues. The expression of CSE is related to the TNM stage of lung cancer patients， the presence or absence of peripheral lymph node metastasis， tumor size， and the degree of tumor differentiation. The level of CSE expression will affect the 5-year survival rate of patients.The research idea of CSE as a target can be used as a reference index to evaluate the early occurrence and prognosis of lung cancer.

Key words：Cystathionine-γ-lyase;Lung cancer;Immunohistochemistry

肺癌（lung cancer）是世最常見的，也是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。肺癌分為小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）兩大類，研究發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%。大部分肺癌患者確診時已處于中晚期，預后很差，因此早期診斷治療肺癌顯得尤為重要。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）分子是目前研究發(fā)現(xiàn)的通過某種特定機制對腫瘤發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要作用的第3種內源性氣體信號分子[1]。其關鍵酶之一——胱硫醚γ裂解酶（CES）則主要分布在血管、肝、肺、腎等[2]。胱硫醚γ裂解酶是否可促進肺癌細胞的增殖與遷移，其與肺癌發(fā)展演變的聯(lián)系值得我們深入研究，且目前有關肺癌組織與胱硫醚γ裂解酶表達的相關性研究較少，本實驗主要對胱硫醚γ裂解酶在肺癌組織中表達及其臨床意義作初步探究，為今后肺癌的治療與預后評估提供新思路。

1資料與方法

1.1一般資料 ?選取2008年12月～2013年12月青島大學附屬青島市市立醫(yī)院醫(yī)院經(jīng)根治性肺葉手術切除并經(jīng)醫(yī)院病理科病理證實的肺癌患者125例，取其肺癌組織標本及癌旁正常肺組織上皮（癌旁正常組織距癌組織5 cm以上）進行實驗。所有患者年齡45～75歲，平均年齡（60.00±15.00）歲，其中男76例，女49例。腫瘤大小≤3 cm 58例，>3 cm 67例;高分化型45例，中分化型33例，低分化型47例;浸潤深度：T1～T2期72例，T3～T4期53例;淋巴結陰性74例，陽性51例，肺鱗癌72例，肺腺癌53例。隨訪時間為手術當日起至末次隨訪時間或死亡，截止至2013年12月1日。

1.2試劑 ?第一抗體CSE：兔抗人CSE單克隆抗體（Boster，CN）購自武漢博士德生物工程有限公司，武漢博士德生物工程有限公司贊助提供CSE兔抗人單克隆抗體（Boster，CN），顯色試劑盒DAB（AR1022）免疫組織化學染色試劑SABC（Boster，CN），枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）;第二抗體兔抗山羊抗體、小鼠抗山羊抗體全部購置于北京中衫金橋生物技術有限公司。DAB二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒購自梅奧森生物技術有限公司;蘇木色精染液、蘇木色精分色液購自北京世濟合力生物科技有限公司;顯微鏡載、蓋玻片7102型購自江蘇鹽城宏達醫(yī)學器材有限公司;中性樹脂購自上海華靈康復醫(yī)學器械廠;移液器槍頭、一次性塑料滴管試管購自上海麥尚科學儀器有限公司。

1.3免疫組化方法 ?①離體標本以10%中性甲醛固定，接著常規(guī)行石蠟包埋，制作備用的組織蠟片并切片，②二甲苯脫蠟切片，利用梯度酒精進行水化;③使用3%H2O2-甲醇溶液在室溫下進行15 min孵育;④結合在微波進行組織抗原修復后使用PBS沖洗3次×3 min;⑤取出保溫箱切片，輕輕甩除血清液，然后滴加配好的一抗，加完后置于4℃冰箱，過夜;⑥用PBS沖洗滴加過一抗處理好的切片3次×5 min，用試水紙拭去切片周圍的PBS液，再小心滴加二抗后放入恒溫箱孵育20 min;⑦DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片;光鏡觀察。PBS溶液替代一抗作為空白對照，已知的陽性切片標本作陽性對照。

1.4結果判斷標準 ?CSE染色判斷標準參照文獻[3]，在光鏡高倍鏡下顏色為棕黃色的陽性表達定位于細胞質，在400高倍鏡視野下隨機選取視野10個，計算腫瘤細胞中陽性表達比例計算百分率;陽性細胞數(shù)目<10%記作為（-）;陽性細胞數(shù)目在10%～25%記作為（+）;陽性細胞數(shù)目波動在25%～50%則記作為（++）;50%以上則記做為（+++）。其中（-）～（+）為低表達，（++）～（+++）為高表達。

1.5統(tǒng)計學方法 ?采用SPSS 13.0軟件進行資料分析，計量資料采用（x±s）表示，計數(shù)資料采用（n）表示，行？字2檢驗，用Kaplan-Meier法進行生存分析并繪制生存曲線評估預后，用Log-rank檢驗分析進行生存檢驗。P<0.05為差異存在統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 CSE在肺癌組織及癌旁正常組織中的表達比較 ?CSE蛋白的陽性部位主要在細胞質中并呈棕黃色表達，其在肺癌組織中高水平表達，而在癌旁正常組織中低表達或不表達，見圖1。CSE在肺癌組織中高表達占比高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 CSE表達與肺癌患者臨床病理特征的關系 ?不同腫瘤TNM分期、周圍淋巴結轉移與否、分化程度及組織類型的肺癌組織中CSE表達水平比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;不同年齡、性別、組織學類型、腫瘤大小的肺癌組織中CSE表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

2.3 CSE與肺癌患者預后的關系 ?125例肺癌患者中，CSE高表達患者5年生存率低于CSE低表達患者，且兩者的5年生存率比較，差異具有統(tǒng)計學意義（？字2=8.884，P=0.003），見圖2。

3 討論

世界上最常見的肺惡性腫瘤因其早期發(fā)現(xiàn)難度大、惡性程度高的特點成為對人類身體健康影響最大的惡性腫瘤之一[4]。研究發(fā)現(xiàn)，新型分子硫化氫作為信號分子對調節(jié)人體機體生理代謝具有重要作用，其生成主要通過組織器官的代謝形成，硫化氫及其酶在內分泌、心血管、神經(jīng)、呼吸、消化等系統(tǒng)中具有調節(jié)人體代謝過程和組織功能。胱硫醚-β合成酶（CBS）、胱硫醚γ裂解酶（CSE）在人體組織細胞中的存在位置具有明顯組織差異性，譬如主動脈、腸系膜動脈、肺動脈存在胱硫醚γ裂解酶的表達卻無胱硫醚-β合成酶分布[5]。而硫化氫與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程關系密切，硫化氫及其酶是通過促進微血管形成、正常血管結構的保持、抑制心肌細胞和抑制腫瘤細胞凋亡等作用來發(fā)揮生理作用。內源性硫化氫在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中通過介導血管生成調節(jié)線粒體生物能、加速細胞周期進程及抗細胞凋亡機制等來發(fā)揮功能。胱硫醚γ裂解酶在多數(shù)惡性腫瘤中表達上調，并且與癌癥侵襲及預后不良密切相關。Cai WJ等研究[8]發(fā)現(xiàn)，CBS和CSE在人結腸癌細胞株HCTll6和SW480中的可產(chǎn)生硫化氫分子，作為外源性硫化氫供體——NaHS也能加速Akt和ERK磷酸化水平，進行濃度依賴性的促進細胞增殖，腫瘤細胞內G0/G1期之比降低，因而進入S細胞數(shù)量增多。NaHS進行干預后周期素依賴性蛋白激酶抑制因子p21w/Cipl和NO的表達存在一定的降低。Cao QH等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CSE和CBS在丁酸鹽處理后刺激結腸癌細胞引起表達量的增高，并加速ERK的磷酸化水平情況來調節(jié)內源性H2S的表達水平，從而抑制結腸癌細胞生長轉移過程。張廣松等[10]在研究膀胱腫瘤中發(fā)現(xiàn)硫化氫與其他氣體分子共同促進生成腫瘤組織營養(yǎng)血管，硫化氫及其合成酶有助于膀胱腫瘤細胞的生長并可抗拒化療藥物的藥理作用。本研究結果顯示，CSE在肺癌組織中高表達占比高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），不同腫瘤TNM分期、周圍淋巴結轉移與否、分化程度及組織類型的肺癌組織中CSE表達水平比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;不同年齡、性別、組織學類型、腫瘤大小的肺癌組織中CSE表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;CSE高表達患者5年生存率低于CSE低表達患者，且兩者的5年生存率比較，差異具有統(tǒng)計學意義（？字2=8.884，P=0.003）。表明CSE在肺癌的發(fā)生浸潤轉移演變過程中具有重要作用，很有可能是促進肺癌發(fā)展演變的重要途徑之一，其發(fā)生機制將是下一步的研究重點。

內源性硫化氫與CO和NO相互作用可促進腫瘤演變過程[11]，CO和NO通過非cGMP和cGMP的信號分子途徑促進血管生長，這提示在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中，硫化氫或其合成酶可能與其他氣體分子有利于營養(yǎng)血管生成。硫化氫的表達同P13K/Akt信號通路具有明顯相關性，有研究就硫化氫及CSE基因表達與腫瘤細胞增殖調控進行探究，但其具體的信號通路尚未被發(fā)現(xiàn)。從理論上講，硫化氫確實存在調節(jié)血管內皮細胞生長因子的功能，并通過促進這些生長因子生成血管新生[12，13]，但具體增殖侵潤的調控機制不明。同時，P13K/Akt信號通路的存在對人體內腫瘤細胞生成具有重要意義[14]，因此本研究推測內源性硫化氫及其酶可能通過對調節(jié)P13K/Akt信號通路從而調控腫瘤細胞的增殖凋亡。在轉錄和翻譯水平上，P13K/Akt信號通路可發(fā)生過度激活后，從而導致腫瘤細胞的增殖生長失去免疫系統(tǒng)的監(jiān)控和控制。

綜上所述，CSE在肺癌組織中呈高表達，CSE的表達與肺癌患者TNM分期、周圍淋巴結發(fā)生轉移與否、腫瘤大小、腫瘤分化程度有關，CSE表達水平會對患者5年生存率造成影響，以CSE為靶點的研究思路可作為評估肺癌早期發(fā)生及預后的參考指標。

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收稿日期：2019-11-27;修回日期：2019-12-09

編輯/成森