酸水解雪松松針總黃酮制備楊梅素工藝的優(yōu)化

劉東彥杜瑞琴石曉峰?李 琳

（1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730030）

雪松Cedrus deodara（Roxb.）Loud.是松科雪松屬樹種的泛稱，包括4 個(gè)亞種，而松針為松科植物的多個(gè)品種的針狀葉，資源豐富，藥用歷史悠久，具有抗腫瘤、抗病毒、改善記憶、毒殺蚊蟲等多種功效［1］。本課題組前期對(duì)雪松松針的化學(xué)成分和抗腫瘤活性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，從中分離得到大量以楊梅素、槲皮素、山柰酚、異鼠李素及其它們的苷類為主的黃酮類化合物［2-5］；對(duì)雪松松針中總黃酮及4 種指標(biāo)成分的含有量進(jìn)行了測(cè)定［6-7］，總黃酮含有量為8.19%，楊梅素含有量為0.022 9%；采用大孔吸附樹脂富集純化得到純度達(dá)54%的雪松松針總黃酮［1，8］；采用MTT法對(duì)雪松松針總黃酮進(jìn)行體外細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)［9］，發(fā)現(xiàn)其總黃酮具有抗癌活性。

楊梅素是廣泛存在于多種天然植物中的一種黃酮類化合物。近年來(lái)，許多學(xué)者致力于對(duì)楊梅素活性方面的研究［10-14］，發(fā)現(xiàn)楊梅素具有抗炎、抗腫瘤、降血糖和保肝等多種藥理活性。本課題組研究發(fā)現(xiàn)楊梅素具有抗腫瘤活性［15］；對(duì)楊梅素制劑及其他方面也有研究，如楊梅素分散片、滴丸、微乳和脂質(zhì)體的研究［16-20］?？傊?，楊梅素是一個(gè)非常有研究?jī)r(jià)值的天然化合物，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)酸水解雪松松針總黃酮制備楊梅素的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到產(chǎn)量較高的楊梅素，以期為雪松松針總黃酮中楊梅素的制備及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

RE-5299 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限公司）；YC-10 多功能提取罐（上海雅程儀器設(shè)備有限公司）；CCBLB 樹脂柱系統(tǒng)（江陰市金確層析設(shè)備有限公司）；AE260 分析天平（萬(wàn)分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；Agilent 1100 高效液相色譜儀、Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美國(guó)安捷倫公司）；SK3310LHC超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

雪松松針于2015 年6 月采自甘肅省隴南市徽縣境內(nèi)，經(jīng)甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院何福江研究員鑒定為雪松屬植物雪松Cedrus deodara（Roxb）G.Don 的松針。

楊梅素對(duì)照品（批號(hào)100504，純度大于98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 酸水解雪松松針總黃酮制備楊梅素

2.1.1 雪松松針總黃酮制備［1］稱取新鮮雪松松針600 g置多功能提取罐中，第1 次加入13 倍量水，第2 次加10倍量水，回流提取，每次2 h，合并提取液，按比例濃縮，依次用70%、85%乙醇醇沉2 次，回收乙醇至無(wú)醇味，加水溶解并定容，得雪松松針?biāo)嵋?。水提液?jīng)XAD 7HP 型大孔樹脂純化，控制上樣液中總黃酮的質(zhì)量濃度為6.9 mg／mL，上樣體積流量為8 BV／h，上樣量為每1 g 樹脂2.0 mL上樣液，待上樣液流完后，用4 BV 水洗脫除雜，再用4 BV 70% 乙醇洗脫，收集乙醇液，減壓濃縮并冷凍干燥，即得。

2.1.2 鹽酸溶液制備 精密吸取一定體積的濃鹽酸，加入50%甲醇，配制成相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鹽酸溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取雪松松針總黃酮0.1 g，按響應(yīng)面試驗(yàn)，加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽酸，于水浴中回流一定時(shí)間，冷卻，置于100 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容，即得。

2.1.4 對(duì)照品溶液制備 精密稱取楊梅素對(duì)照品1.02 mg，置10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容，配制成質(zhì)量濃度為100 μg／mL 的貯備液，精密吸取該貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，流動(dòng)相定容，配制成質(zhì)量濃度為10 μg／mL 的對(duì)照品溶液，備用。

2.2 楊梅素含有量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B）（22∶78）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；進(jìn)樣量20 μL。該條件下楊梅素出峰時(shí)間為16.2 min，與其雜質(zhì)峰的分離度＞1.5，理論塔板數(shù)不小于7 000，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 楊梅素HPLC 色譜圖

2.2.2 線性關(guān)系考察 依次吸取“2.1.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 至1 mL量瓶中，流動(dòng)相定容，搖勻，配制成系列質(zhì)量濃度的楊梅素對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得到方程為Y＝54.067X+1.745（R2＝0.999 7），表明楊梅素在0.5～6.0 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 單因素試驗(yàn)［21］

2.3.1 鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) 稱取雪松松針總黃酮0.1 g，共4 份，分別加入2%、4%、6%、8% 鹽酸溶液30 mL，于95 ℃水浴回流1.5 h，冷卻，置于100 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，見(jiàn)圖2。由圖2 可知，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽酸對(duì)雪松松針總黃酮水解效果的影響很明顯，4%鹽酸水解液中楊梅素含有量最高。

2.3.2 料液比 稱取雪松松針總黃酮0.1 g，共4 份，分別加入4%鹽酸溶液10、20、30、40 mL，于95 ℃水浴回流1.5 h，冷卻，置于100 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，見(jiàn)圖3。由圖3 可知，水解液中楊梅素含有量隨著料液比的提升呈上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶300時(shí)趨于最高。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)鹽酸對(duì)楊梅素含有量的影響

2.3.3 水解時(shí)間 稱取雪松松針總黃酮0.1 g，共4份，加入4% 鹽酸溶液30 mL，于95 ℃水浴分別回流0.5、1.0、1.5、2.0 h，冷卻，置于100 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，見(jiàn)圖4。由圖4 可知，水解液中楊梅素含有量隨著水解時(shí)間的提升呈上升趨勢(shì)，當(dāng)水解1.5 h 以上時(shí)開(kāi)始降低，因此選用0.5～1.5 h。

圖3 不同料液比對(duì)楊梅素含有量的影響

圖4 不同水解時(shí)間對(duì)楊梅素含有量的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)［22］

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、水解時(shí)間（C）作為影響因素，楊梅素含有量（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.2 模型擬合 利用Design-Expert 8.0.5 軟件，以楊梅素含有量（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、水解時(shí)間（C）進(jìn)行二次多項(xiàng)式模型方程擬合，得到二元多項(xiàng)回歸模型為Y＝0.24-8.250×10-3A+0.012B+0.011C-4.050×10-3AB+1.750× 10-3AC-4.750×10-4BC-0.031A2-0.020B2-0.014C2，（R2＝0.951 7），方差分析見(jiàn)表2。

表2 方差分析

表2 顯示，模型P值為0.000 8，達(dá)到了極顯著水平；決定系數(shù)R2＝0.951 7，校正系數(shù)＝0.889 7，表明試驗(yàn)結(jié)果有88.97% 受到各因素的影響；失擬項(xiàng)P＝0.975 7＞0.05，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)沒(méi)有異常點(diǎn)；交互項(xiàng)AB、AC和BC對(duì)楊梅素含有量的影響無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明A、B、C之間交互影響較??；一次項(xiàng)A、B和C與二次項(xiàng)A2、B2和C2均有顯著性差異（P＜0.05），表明回歸方程能夠預(yù)測(cè)楊梅素含有量變化；各因素影響程度依次為料液比＞水解時(shí)間＞鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

通過(guò)軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，得最優(yōu)工藝為鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.71%，料液比1∶330.61，水解時(shí)間1.19 h，楊梅素含有量為0.242 8%。

2.4.3 響應(yīng)面法分析 通過(guò)軟件作出相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖，見(jiàn)圖5。AB響應(yīng)面圖中，B因素的坡度較陡，對(duì)楊梅素含有量的影響大于A因素；同法考察AC、BC響應(yīng)面圖，確定各因素對(duì)楊梅素含有量的影響程度依次為料液比＞水解時(shí)間＞鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，與方差分析結(jié)果一致。等高線圖的形狀反映各因素之間的交互作用，若呈橢圓形，表明兩因素的交互作用顯著，若呈圓形則不顯著，而本實(shí)驗(yàn)AB、AC、BC的等高線圖均比較圓，表明各因素之間的交互作用對(duì)楊梅素含有量的影響不顯著。

圖5 各因素響應(yīng)面分析圖

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 在實(shí)際操作中，將“2.4.2”項(xiàng)下優(yōu)化工藝參數(shù)調(diào)整為鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.7%，料液比1∶330，水解時(shí)間1.2 h，楊梅素平均含有量為0.247 6%（n＝3，RSD＝0.798%），與預(yù)測(cè)值0.242 8%的相對(duì)誤差為1.94%，表明工藝準(zhǔn)確可靠、合理可行。

3 討論

松針是松科松屬植物的針葉，又名松葉、松毛等，為松科植物的主要副產(chǎn)物之一，是一種再生速度快、可持續(xù)利用的天然資源。課題組前期從雪松松針提取物中測(cè)得楊梅素最高含有量為0.022 9%［7］，游離楊梅素很少，且具有強(qiáng)氧化性，在制備總黃酮過(guò)程已損失，純化后未測(cè)出單體楊梅素。課題組前期從雪松松針中分離得到許多楊梅素苷類化合物［2-5］，苷鍵具有縮醛結(jié)構(gòu)，易被稀酸催化水解，苷鍵斷裂得到楊梅素和糖，雪松松針總黃酮經(jīng)鹽酸水解后楊梅素含有量達(dá)0.247 6%，而且在酸性溶液中穩(wěn)定性好［23］，更有利于進(jìn)一步純化。

植物中總黃酮的水解常用甲醇-鹽酸體系［24-25］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇-鹽酸、50% 甲醇-鹽酸、水-鹽酸的水解效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-鹽酸體系對(duì)雪松松針總黃酮的溶解效果差；水-鹽酸體系水解總黃酮后析出不溶物苷元；將同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%甲醇-鹽酸和水-鹽酸體系進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者水解總黃酮后楊梅素含有量較后者高出1 倍，故本實(shí)驗(yàn)采用50%甲醇-鹽酸體系進(jìn)行水解。

本實(shí)驗(yàn)建立的酸水解雪松松針總黃酮制備楊梅素的最優(yōu)工藝為鹽酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.7%，料液比1∶330，水解時(shí)間1.2 h，楊梅素含有量為0.247 6%，與預(yù)測(cè)值0.242 8% 接近，可知該工藝合理可行，能得到產(chǎn)量較高的楊梅素，并為該成分制備及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。