熱打擊誘導(dǎo)肝細(xì)胞釋放的外泌體生物學(xué)功能及其致肝損傷作用分析

李悅，祝鑫桃，張明，梁泳欣，施學(xué)智，童華生*

1解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科/解放軍熱區(qū)損傷與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510010；2廣州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院/清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東清遠(yuǎn) 511500

外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種，可介導(dǎo)各種生物活性分子(如蛋白、脂質(zhì)、mRNA和microRNA)在細(xì)胞間傳遞并影響靶細(xì)胞的功能，構(gòu)成新的細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)[8-10]。外泌體因其穩(wěn)定性高，膜結(jié)構(gòu)保護(hù)內(nèi)含物不易降解，作用時(shí)間窗寬及疾病、臟器特異性高等特點(diǎn)，作為細(xì)胞間相互作用方式具有很大優(yōu)勢(shì)[11]。肝細(xì)胞是肝臟的主要外泌體分泌細(xì)胞，且相對(duì)易損，可最早感受到各種損傷應(yīng)激因素。肝細(xì)胞不但是被動(dòng)損傷的靶點(diǎn)，還通過釋放“危險(xiǎn)信號(hào)”的方式積極主動(dòng)參與肝損傷[12]。不同于免疫細(xì)胞直接釋放炎性因子作為危險(xiǎn)信號(hào)，實(shí)質(zhì)細(xì)胞如肝細(xì)胞等釋放危險(xiǎn)信號(hào)的主要方式為對(duì)內(nèi)源性細(xì)胞組分的“再利用”，如損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattern，DAMP)[13]。肝細(xì)胞外泌體損傷應(yīng)激后分泌的一種DAMP在各種肝臟病理生理機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，可介導(dǎo)肝損傷[14-15]。但肝細(xì)胞外泌體在重癥中暑合并急性肝損傷中的作用目前尚不清楚。本研究擬對(duì)中暑后肝細(xì)胞釋放的外泌體進(jìn)行鑒定，進(jìn)行蛋白質(zhì)譜KEGG通路分析并驗(yàn)證中暑誘導(dǎo)的肝細(xì)胞來源的外泌體是否參與重癥中暑肝損傷。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。42只6～8周齡健康雄性C57BL/6小鼠(20～25 g)購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胎牛血清(FBS)、DMEM購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。BCA測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Themo Fisher Scientific公司。Fomvar Carbon銅網(wǎng)購(gòu)自加拿大Mecalab公司。透射電子顯微鏡(型號(hào)2100F)購(gòu)自日本JEM公司。納米粒子跟蹤分析儀(型號(hào)NS300)購(gòu)自英國(guó)Worcestershire公司。外泌體PKH67綠色熒光染料試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司。CD63抗體(型號(hào)ab10895)和CD9抗體(型號(hào)ab92726)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。CD81抗體(型號(hào)18250-1-AP)和GAPDH抗體(型號(hào)60004-1-Ig)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司?？股窖?、抗兔或抗小鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Li-cor公司。GW4869(外泌體釋放抑制劑)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 供體肝細(xì)胞外泌體的分離及鑒定

1.2.1 供體肝細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為對(duì)照組(不做任何處理)與熱打擊組(將HepG2細(xì)胞更換無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h后放入43 ℃高溫培養(yǎng)箱處理1 h，立即轉(zhuǎn)移至37 ℃孵箱復(fù)溫9 h)兩組。

1.2.2 外泌體分離 收集對(duì)照組和熱打擊組肝細(xì)胞上清，低速離心去除細(xì)胞、死細(xì)胞及細(xì)胞碎片。隨后300×g、4 ℃離心10 min，棄沉淀(細(xì)胞)，收集上清至50 ml離心管。2000×g、4 ℃離心20 min，棄沉淀(死細(xì)胞)，收集上清至50 ml離心管。10 000×g、4 ℃離心30 min，棄沉淀(亞細(xì)胞成分)，收集上清至50 ml離心管。0.22 μm過濾器過濾1次，去除凋亡小體、微囊泡和細(xì)胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移至超高速離心機(jī)，100 000×g、50.2 Ti轉(zhuǎn)子(k因子：157.7)，4 ℃離心70 min沉淀外泌體。小心吸去上清，留高于沉淀2 mm的上清。將含有外泌體的沉淀加入1 ml預(yù)冷PBS重懸，100 000×g、4 ℃離心70 min，沉淀加入30～100 μl PBS重懸，收集至1.5 ml EP管中。

醫(yī)生根據(jù)患者的年齡、性別、生活習(xí)慣、身體狀況，為患者設(shè)定預(yù)警值；當(dāng)患者數(shù)據(jù)超過預(yù)警值，系統(tǒng)將發(fā)出警報(bào)，自動(dòng)推送預(yù)警信息；系統(tǒng)根據(jù)需要，將患者某一時(shí)間段內(nèi)某個(gè)指標(biāo)的歷史變化和預(yù)警值，繪制到一張圖上，進(jìn)行直觀展示；用戶可以選擇時(shí)間段，查詢患者的歷史預(yù)警記錄。

1.2.3 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài) 將外泌體加入Fomvar Carbon銅網(wǎng)中，1%戊二醛固定，1%草酸雙氧鈾染色，用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)。

1.2.4 納米顆粒追蹤分析(NTA)檢測(cè)外泌體的粒徑及濃度 通過納米粒子跟蹤分析儀測(cè)量外泌體直徑和濃度分布，按說明書操作。外泌體樣品用無(wú)菌PBS稀釋(1:5000)，每個(gè)樣品分析60 s，Nanosight自動(dòng)分析設(shè)置測(cè)量3次。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)特征表面標(biāo)記物的表達(dá)水平 取等量外泌體沉淀或細(xì)胞裂解物加入5×上樣緩沖液并煮沸，并在12%SDS-PAGE凝膠上分離。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下5%BSA封閉1 h。PVDF膜4 ℃與CD63、CD9、CD81和GAPDH一抗孵育過夜。TBST緩沖液洗滌膜3次，室溫下與抗山羊、抗兔或抗小鼠二抗溫育1 h。TBST緩沖液洗滌膜3次，使用Odessy系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)，Gel軟件進(jìn)行定量分析。

1.3 外泌體標(biāo)記及體內(nèi)外攝取實(shí)驗(yàn)

1.3.1 外泌體標(biāo)記 PKH67標(biāo)記肝細(xì)胞外泌體：用PBS稀釋外泌體后加入4 μl PKH67染料溫育4 min。隨后加入2 ml 0.5%的BSA，100 000×g離心洗滌標(biāo)記外泌體1 h，得到外泌體沉淀用于體外體內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 體外攝取實(shí)驗(yàn) 將受體肝細(xì)胞分為PKH-67外泌體刺激組(刺激組)與對(duì)照組。刺激組：加入10 μg PKH67標(biāo)記外泌體；對(duì)照組：加入1 ml無(wú)菌PBS。6 h后用共聚焦顯微鏡觀察外泌體攝取情況。

1.3.3 體內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn) 將小鼠分為PKH-67外泌體輸注組(輸注組)與對(duì)照組，每組6只。輸注組：尾靜脈注射40 μg PKH67標(biāo)記的外泌體；對(duì)照組：尾靜脈注射5 ml無(wú)菌PBS。4 h后處死，取小鼠肝組織行冰凍切片，用共聚焦顯微鏡觀察外泌體攝取情況。

1.4 肝細(xì)胞外泌體等重同位素多標(biāo)簽相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)(iTRAQ)分析

1.4.1 樣品制備 將對(duì)照組或熱打擊肝細(xì)胞外泌體加入適量SDT裂解液，沸水浴15 min。14 000×g離心15 min后，取上清。采用BCA試劑盒法對(duì)蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。將樣品分裝后，于-80 ℃保存。

1.4.2 SDS-PAGE蛋白電泳 各組樣品取20 μg蛋白質(zhì)，分別加入1/4體積的5×上樣緩沖液，沸水浴10 min，行12%SDS-PAGE電泳(恒壓250 V，40 min)，考馬斯亮藍(lán)染色。

1.4.3 FASP酶解 取30 μl各組樣品的蛋白質(zhì)溶液，分別加入適量DTT至終濃度100 mmol/L，沸水浴5 min，冷卻至室溫；加入200 μl尿酸緩沖液混勻，轉(zhuǎn)移至30 kD超濾離心管中，14 000×g離心15 min后吸棄濾液(該步驟重復(fù)1次)；加入100 μl IAA緩沖液，600 r/min振蕩1 min，室溫下充分反應(yīng)30 min后(避光)，14 000×g離心5 min；加入100 μl尿酸緩沖液，14 000×g離心15 min(該步驟重復(fù)2次)；加入100 μl 10倍稀釋的溶解緩沖液，14 000×g離心15 min(該步驟重復(fù)2次)；加入40 μl胰酶緩沖液，600 r/min振蕩1 min，37 ℃孵育16～18 h；更換新的收集管，14 000×g離心15 min，再加入40 μl 10倍稀釋的溶解緩沖液，14 000×g離心15 min后收集濾液。用Nano Drop 2000對(duì)樣品進(jìn)行肽段定量。

1.4.4 iTRAQ標(biāo)記 各樣品分別取100 μg肽段，按照iTRAQ標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。

1.4.5 High PH RP分級(jí) 將每組標(biāo)記后的肽段混合后，采用Agilent 1260 infinity II HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)。緩沖液A液為10 mmol/L HCOONH4，5%ACN，pH值10.0，B液為10 mmol/L HCOONH4，85%ACN，pH值10.0。色譜柱以A液平衡，樣品由手動(dòng)進(jìn)樣器上樣到色譜柱進(jìn)行分離，流速為1 ml/min。液相梯度如下：0～25 min，B液0%；25～30 min，B液線性梯度從0%～7%；30～65 min，B液線性梯度從7%～40%；65～70 min，B液線性梯度從40%～100%；70～85 min，B液維持在100%。洗脫過程中監(jiān)測(cè)214 nm的吸光度值，每隔1 min收集洗脫組分，共計(jì)收集洗脫組分約36份。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將樣品凍干后用0.1%FA復(fù)溶，合并為3份。

1.4.6 質(zhì)譜分析

1.4.6.1 Easy nLC色譜 每份樣品采用納升流速Easy nLC系統(tǒng)進(jìn)行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為80%)。色譜柱以100%的A液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到分析柱(Thermo Scientific公司，Acclaim PepMap RSLC 50 μm×15 cm，nano viper，P/N164943)分離，流速為300 nl/min。選擇2 h液相梯度：0～5 min，B液線性梯度從0%～6%；5～105 min，B液線性梯度從6%～28%；105～110 min，B液線性梯度從28%～38%；110～115 min，B液線性梯度從38%～100%；115～120 min，B液維持在100%。

1.4.6.2 質(zhì)譜鑒定 色譜分離后，利用Q-Exactive Plus質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)為60/120 min(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而定)，檢測(cè)方式為正離子，母離子掃描范圍350～1800 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000，AGC目標(biāo)為3×106，一級(jí)IT最大值為50 ms。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集10個(gè)碎片圖譜。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析 原始數(shù)據(jù)用Mascot 2.5及Proteome Discoverer 2.1軟件進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。

1.5 外泌體刺激受體肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將受體肝細(xì)胞分為對(duì)照組、正常肝細(xì)胞外泌體刺激組(正常刺激組)、熱打擊肝細(xì)胞外泌體刺激組(熱打擊刺激組)、熱打擊組及熱打擊+GW4869預(yù)處理組(熱打擊預(yù)處理組)。熱打擊組參照1.2.1方法進(jìn)行處理；熱打擊預(yù)處理組在熱打擊前2 h用GW4869(20 μg/ml培養(yǎng)上清)預(yù)處理，抑制內(nèi)源性外泌體；兩個(gè)刺激組分別加入正常肝細(xì)胞外泌體或熱打擊肝細(xì)胞外泌體(10 μg/5 ml培養(yǎng)上清)作用24 h；對(duì)照組不進(jìn)行熱打擊或外泌體刺激處理，其他步驟相同。按試劑盒說明書檢測(cè)各組ALT、AST和LDH水平。

1.6 外泌體體內(nèi)回輸刺激實(shí)驗(yàn) 將小鼠分為對(duì)照組、正常肝細(xì)胞外泌體輸注組(正常輸注組)、熱打擊肝細(xì)胞外泌體輸注組(熱打擊輸注組)、熱打擊組及熱打擊+GW4869預(yù)處理組(熱打擊預(yù)處理組)，每組6只。實(shí)驗(yàn)間期自由進(jìn)食飲水，12 h交替光/暗控制。嚴(yán)格按照現(xiàn)行倫理規(guī)定及指南進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。兩個(gè)輸注組分別經(jīng)尾靜脈輸注正常肝細(xì)胞外泌體或熱打擊肝細(xì)胞外泌體(40 μg/只)，作用24 h。熱打擊組：于熱打擊前20 min禁食禁水，將小鼠置于孵育箱，溫度在30 min內(nèi)升高至39.0 ℃，相對(duì)濕度為60%；在直腸中插入1～5 cm肛溫計(jì)，間隔10 min測(cè)量核心溫度(Tc)，Tc達(dá)42.5 ℃時(shí)，認(rèn)為中暑發(fā)生；將小鼠從孵育箱中取出稱重，室溫下自由飲水進(jìn)食，9 h后處死。熱打擊預(yù)處理組：熱打擊前2 h自尾靜脈注射GW4869(2 mg/kg)。對(duì)照組不進(jìn)行熱打擊或外泌體輸注，其他步驟相同。取以上5組小鼠血清，按試劑盒說明書檢測(cè)ALT、AST和LDH水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，兩組比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組比較時(shí)，若方差齊使用One-way ANOVA檢驗(yàn)，方差不齊用Welch法，進(jìn)一步兩兩比較用post-hoc事后分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝細(xì)胞外泌體鑒定 外泌體呈雙層膜狀包裹的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)，直徑約100 nm(圖1A)。NTA檢測(cè)示肝細(xì)胞釋放囊泡直徑為90～150 nm，符合外泌體典型的直徑分布特征(圖1B)。Western blotting檢測(cè)囊泡外泌體特征表面標(biāo)志物顯示外泌體高表達(dá)CD9、CD63和CD81(圖1C)，表明分離的外泌體具有高純度。中暑組肝細(xì)胞釋放的外泌體數(shù)量明顯高于對(duì)照組[(8.46±1.38)×109/mlvs.(0.66±0.16)×109/ml，t=5.605，P=0.005]。

2.2 中暑肝細(xì)胞外泌體體外及體內(nèi)攝取實(shí)驗(yàn)PKH-67標(biāo)記HepG2細(xì)胞外泌體加入受體HepG2細(xì)胞作用6 h后，共聚焦顯微鏡觀察顯示，受體肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯PKH67綠色熒光，表明外泌體被受體肝細(xì)胞內(nèi)化(圖2A)。通過尾靜脈內(nèi)注射PKH-67染色中暑供體肝細(xì)胞外泌體注入C57BL6小鼠4 h，共聚焦顯微鏡可觀察到肝臟對(duì)外泌體的吸收(圖2B)。

圖1 肝細(xì)胞外泌體特征鑒定Fig.1 Identification of hepatocyte exosomes characteristics

2.3 中暑肝細(xì)胞外泌體KEGG通路富集分析iTRAQ定量蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，熱打擊明顯改變了肝細(xì)胞外泌體蛋白的表達(dá)，表達(dá)上調(diào)前10位的蛋白質(zhì)基因名見圖3A。隨后使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的蛋白質(zhì)進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示中暑外泌體高表達(dá)通路包括壞死性凋亡途徑、PI3K(磷脂酰肌醇3'-激酶)-Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑、抗原加工和呈遞途徑、凋亡途徑及NOD樣受體信號(hào)通路(圖3B)。

圖2 共聚焦顯微鏡觀察中暑肝細(xì)胞外泌體的體內(nèi)及體外攝取Fig.2 Uptake in vivo and in vitro of exosomes in heatstroke hepatocyte (confocal microscopy)

圖3 中暑肝細(xì)胞外泌體KEGG通路富集分析Fig.3 Enrichment analysis of KEGG pathway of exosomes in heatstroke hepatocyte

2.4 外泌體刺激受體肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 體外刺激實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，熱打擊刺激組、熱打擊組肝細(xì)胞上清ALT、AST、LDH水平均明顯升高(P＜0.05)，而正常刺激組則無(wú)明顯變化。熱打擊預(yù)處理組的上述指標(biāo)明顯低于熱打擊組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

2.5 外泌體體內(nèi)回輸刺激實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組比較，熱打擊輸注組和熱打擊組小鼠血清ALT、AST、LDH水平明顯升高(P＜0.05)，而正常輸注組無(wú)明顯變化。熱打擊預(yù)處理組上述指標(biāo)水平明顯低于熱打擊組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表1 各組小鼠肝細(xì)胞上清ALT、AST、LDH水平比較(U/L，，n=3)Tab.1 Comparison of ALT, AST, LDH levels in supernatants of hepatocyte in each group (U/L, , n=3)

表1 各組小鼠肝細(xì)胞上清ALT、AST、LDH水平比較(U/L，，n=3)Tab.1 Comparison of ALT, AST, LDH levels in supernatants of hepatocyte in each group (U/L, , n=3)

ALT.谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST.谷草轉(zhuǎn)氨酶；LDH.乳酸脫氫酶；與對(duì)照組比較，(1)P＜0.05；與熱打擊刺激組比較，(2)P＜0.05；與熱打擊組比較，(3)P＜0.05。

組別 ALT AST LDH對(duì)照組 14.31±2.57 13.39±3.02 14.75±3.16正常刺激組 24.61±10.62 26.61±12.91 20.15±7.81熱打擊刺激組 126.90±15.26(1) 114.61±12.38(1) 110.00±17.37(1)熱打擊組 109.91±10.39(1) 136.90±19.47(1) 103.51±26.43(1)熱打擊預(yù)處理組 53.34±12.38(2)(3) 57.41±2.54(2)(3) 49.05±15.95(2)(3)

表2 各組小鼠血清ALT、AST、LDH水平比較(U/L，，n=6)Tab.2 Comparison of serum ALT, AST, LDH levels in each group of mice (U/L, , n=6)

表2 各組小鼠血清ALT、AST、LDH水平比較(U/L，，n=6)Tab.2 Comparison of serum ALT, AST, LDH levels in each group of mice (U/L, , n=6)

ALT.谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST.谷草轉(zhuǎn)氨酶；LDH.乳酸脫氫酶；與對(duì)照組比較，(1)P＜0.001；與熱打擊輸注組比較，(2)P＜0.001；與熱打擊組比較，(3)P＜0.001。

組別 ALT AST LDH對(duì)照組 27.37±9.74 25.47±5.09 29.31±5.56正常輸注組 27.71±1.94 24.47±3.91 29.64±4.49熱打擊輸注組 89.61±10.56(1) 92.63±4.97(1) 91.00±8.03(1)熱打擊組 106.30±6.11(1) 99.31±9.47(1) 97.67±3.78(1)熱打擊預(yù)處理組 53.46±11.04(2)(3) 57.71±4.99(2)(3) 57.97±4.70(2)(3)

3 討 論

外泌體是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞間通訊方式，可在相鄰或遠(yuǎn)處細(xì)胞之間運(yùn)輸各種信號(hào)分子，從而參與下游靶細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)及各種生理病理過程。幾乎所有細(xì)胞都可以分泌外泌體，且外泌體幾乎存在于所有人體體液中，包括血液、膽汁、腹水、唾液、乳汁、腦脊液、尿液、羊水和精液。如何分離到高純度的外泌體是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。超高速梯度離心法被認(rèn)為是最經(jīng)典的外泌體分離方法[16]，可以獲得高純度的外泌體。本研究通過對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行43 ℃熱打擊后降溫9 h，隨后超高速梯度離心上清提取沉淀，通過形態(tài)學(xué)、直徑分布及特征性表面標(biāo)記物對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。結(jié)果在透射電鏡下觀察到的囊泡形態(tài)符合典型的外泌體特征：?jiǎn)蝹€(gè)分布，呈圓形或橢圓形，可見明顯的膜性結(jié)構(gòu)；但仍需進(jìn)一步與其他外形相似的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行鑒別。外泌體是來源于內(nèi)體的囊泡，其大小是由電鏡下觀察到的多泡小體(MVB)中的囊泡(ILV)大小來界定的，也是其與其他類型細(xì)胞外囊泡(EV)的重要區(qū)別。由于電鏡測(cè)算ILV的直徑為30～100 nm，也可能略大一些，可達(dá)到150 nm，因此認(rèn)為外泌體的直徑范圍也在此區(qū)間。而EV是由細(xì)胞膜直接向外出芽產(chǎn)生的，或者是細(xì)胞死亡后釋放的凋亡小體，其大小范圍不受限制，異質(zhì)性較強(qiáng)，可大至數(shù)微米，或者比外泌體更小。本研究經(jīng)過納米追蹤技術(shù)測(cè)定的囊泡直徑分布絕大部分在30～150 nm的區(qū)間，在外泌體典型直徑范圍內(nèi)。但仍有部分其他類型的胞外囊泡大小與外泌體相近，另外也有相似大小的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，這些都不能很好地區(qū)分。生物化學(xué)上，外泌體含有常見的“標(biāo)記蛋白”(如內(nèi)體特異性四跨膜蛋白：CD9、CD10、CD26、CD53、CD63、CD81、CD82；參與MVB生物發(fā)生的內(nèi)體相關(guān)蛋白：Alix和Tsg101等)，但不表達(dá)細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體相關(guān)的蛋白。本研究通過Western blotting方法檢測(cè)分離的分泌物中上述特征性標(biāo)記蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外泌體高表達(dá)CD9、CD63及CD81，說明中暑能誘導(dǎo)肝細(xì)胞釋放外泌體，且經(jīng)過經(jīng)典的超高速梯度離心法分離到的肝細(xì)胞外泌體具有較高的純度。這是下一步研究能夠進(jìn)行的先決條件。雖然筆者選擇了常用的外泌體標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，但目前關(guān)于標(biāo)記物的選擇仍沒有固定的金標(biāo)準(zhǔn)，原因在于外泌體形成過程中其膜結(jié)構(gòu)的多樣性，以及與其他類型囊泡的結(jié)構(gòu)相似性[17]。更精確的生物標(biāo)記物仍有待進(jìn)一步研究。

外泌體在不同的應(yīng)激條件下，可主動(dòng)選擇富集其內(nèi)含物，發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。因此分析它們的蛋白質(zhì)或RNA內(nèi)含物的表達(dá)差異可以提供外泌體與疾病相關(guān)性的信息，并篩選用于診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的新型生物標(biāo)志物。在肝臟疾病中，全面蛋白質(zhì)組學(xué)分析和miRNA測(cè)序均顯示藥物誘導(dǎo)的肝損傷(DILI)和酒精性肝炎中血清外泌體蛋白/miRNA的表達(dá)譜發(fā)生改變[18-20]。在非酒精性肝炎中，也揭示了外泌體中高表達(dá)的蛋白質(zhì)與其病理機(jī)制之間的聯(lián)系，并篩選出候選蛋白/miRNA作為預(yù)測(cè)器官損傷的新型標(biāo)記物[20]。肝細(xì)胞是肝臟中主要的實(shí)質(zhì)和功能細(xì)胞以及主要的外泌體分泌細(xì)胞，且肝細(xì)胞不僅是熱損傷的主要靶細(xì)胞，更能積極主動(dòng)參與誘導(dǎo)進(jìn)一步損傷。研究中暑肝細(xì)胞衍生的外泌體如何介導(dǎo)肝細(xì)胞之間的通訊及在肝損傷中的作用可以提供對(duì)中暑肝損傷發(fā)病機(jī)制的新理解。

中暑肝損傷的機(jī)制目前尚不清楚，動(dòng)物中暑模型和臨床中暑患者肝臟的病理變化主要表現(xiàn)為大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞剝脫，肝竇內(nèi)局部微血栓形成，肝細(xì)胞變性或氣球樣變或絨毛扁平，肝細(xì)胞膜破裂等，這種病理改變以肝竇周邊肝細(xì)胞最為明顯，提示一方面高熱可能對(duì)肝細(xì)胞造成直接損傷，另一方面肝細(xì)胞損傷后啟動(dòng)的多種繼發(fā)性損害因素如失衡的炎癥反應(yīng)對(duì)肝細(xì)胞的再次損傷可能更為重要。本研究通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，中暑刺激下肝細(xì)胞釋放的外泌體中的蛋白質(zhì)參與各種細(xì)胞死亡、炎癥信號(hào)通路的激活，如NOD樣受體信號(hào)通路，壞死性凋亡(一種炎癥性死亡模式)，抗原提呈與加工等。同時(shí)證明了中暑肝細(xì)胞外泌體通過被受體肝細(xì)胞或體內(nèi)肝臟攝取，在體外和體內(nèi)均能誘導(dǎo)肝損傷，初步表明中暑肝細(xì)胞釋放的外泌體可能通過激活受體細(xì)胞上述通路在誘導(dǎo)肝臟炎癥損傷過程中發(fā)揮作用。

本研究尚有不足之處：熱打擊肝細(xì)胞外泌體高表達(dá)多種參與炎癥信號(hào)的通路及相關(guān)蛋白質(zhì)，本研究沒有進(jìn)一步直接研究其促進(jìn)中暑肝損傷的具體機(jī)制。除蛋白質(zhì)外，外泌體還含有其他成分，如核酸、脂質(zhì)，這些物質(zhì)也影響外泌體和靶細(xì)胞的生物學(xué)功能，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了熱打擊誘導(dǎo)下肝細(xì)胞釋放的外泌體參與了中暑急性肝損傷過程，經(jīng)超高速梯度離心法分離獲得的熱打擊肝細(xì)胞外泌體純度較高；熱打擊肝細(xì)胞外泌體在體外可被受體肝細(xì)胞內(nèi)吞，在體內(nèi)也可被肝臟攝取，外泌體富集參與炎癥損傷的信號(hào)通路的蛋白質(zhì)，在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)肝損傷。