MicroRNAs在酒精性脂肪肝形成機制中的作用研究進展

左志華，姜瑤，樊佳，陶華林*，郭永燦*

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，四川瀘州 646000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，四川瀘州 646000

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)是指長期大量飲酒后，肝細胞發(fā)生脂肪變性等一系列病理變化，可向脂肪性肝纖維化演變[1-2]，最終導(dǎo)致脂肪性肝硬化[3]。目前對AFLD形成機制的研究主要包括脂質(zhì)代謝異常、免疫炎癥反應(yīng)、腸道菌群失調(diào)等途徑，其中大部分研究停留在AFLD組織細胞層次，其分子機制尚不清楚，且AFLD缺乏早期診斷標(biāo)志物，嚴(yán)重阻礙了本病的診斷及治療[4]。

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類大小為20～25 bp的非編碼RNA，主要通過與mRNA 3'-UTR區(qū)域完全或非完全配對，引起mRNA翻譯受抑或降解[5]，從而導(dǎo)致機體內(nèi)蛋白質(zhì)水平發(fā)生改變[6]。近年來研究證實，miRNAs在AFLD中參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運及代謝，同時對AFLD中相關(guān)蛋白的表達水平具有重要影響[7]。因此了解miRNAs在AFLD形成中的作用，可能是研究AFLD發(fā)病機制及發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點的重要方向。本文對近年來發(fā)現(xiàn)的參與AFLD形成機制中相關(guān)信號通路基因的miRNAs進行綜述，闡釋miRNAs在AFLD中的作用。

1 參與調(diào)控脂肪肝形成的miRNAs

正常肝細胞主要負責(zé)脂肪的消化吸收、合成轉(zhuǎn)運及運輸?shù)冗^程，而脂肪肝主要表現(xiàn)為肝細胞發(fā)生脂肪變性，脂肪異常累積過多。大量研究證實，miRNAs在脂肪肝的形成中起重要作用(表1)。如miR-21在非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)中通過靶向抑制基因3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)來調(diào)節(jié)肝細胞中三酰甘油與膽固醇的代謝[8]，而miR-149作用的靶基因是肝細胞內(nèi)重要的脂質(zhì)調(diào)節(jié)因子——成纖維細胞形成因子-21(fibroblast growth factor-21，F(xiàn)GF-21)，它可以負性調(diào)控FGF-21蛋白的表達水平[9]。

此外，肝細胞炎癥及凋亡也是促進脂肪肝形成的重要因素。早期研究證實，miR-155及miR-26b通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)來促進肝細胞炎癥進展[10-11]，且miR-155還可以通過直接靶向抑制肝X受體α(liver X receptor α，LXRα)而誘導(dǎo)膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(sterolregulatory element binding protein 1，SREBP-1)的高表達，進而促進肝細胞內(nèi)脂代謝及脂質(zhì)的積累[12]。同時Zhao等[13]通過小鼠實驗證實了miR-200a可作用于靶基因E盒鋅指結(jié)合蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)，從而介導(dǎo)脂肪肝細胞的凋亡。

表1 miRNAs在脂肪肝中的調(diào)控通路與作用機制Tab.1 Regulatory pathways and mechanisms of miRNAs in fatty liver

2 miRNAs參與AFLD形成的機制

AFLD與NAFLD的形成機制存在共同之處，包括許多脂質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子與疾病發(fā)展的相關(guān)途徑，如NAD-依賴性的去乙?；?(sirtuin 1，SIRT1)、過氧化物酶體增殖激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα)、叉頭框蛋白O1(human forkhead box protein O1，F(xiàn)OXO1)、胰島素抵抗途徑等[33]。在AFLD中，乙醇不僅能直接對肝細胞產(chǎn)生毒性作用，引起脂質(zhì)代謝紊亂，同時還能刺激肝臟免疫細胞的激活及腸道屏障功能的失效，并通過介導(dǎo)炎性介質(zhì)的改變導(dǎo)致肝細胞炎癥。大量動物實驗及細胞實驗通過基因芯片技術(shù)證明AFLD對miRNAs的表達具有明顯的調(diào)節(jié)作用。例如，Dolganiuc等[34]通過微陣列分析了乙醇喂養(yǎng)小鼠肝臟中miRNAs的表達情況，結(jié)果顯示，miR-27b、miR-214、miR-182表達下調(diào)，miR-705、miR-1224表達上調(diào)。Stickel等[4]對35例酒精性肝炎患者進行研究發(fā)現(xiàn)，包括miR-182等111種miRNAs表達上調(diào)，miR-21、miR-155、miR-214等66種miRNAs表達下調(diào)。

2.1 miRNAs通過參與調(diào)控脂質(zhì)代謝促進AFLD形成 在AFLD形成過程中，脂質(zhì)代謝異常起關(guān)鍵作用。乙醇能夠影響細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，干擾脂質(zhì)代謝通路中重要的脂質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，引起脂質(zhì)代謝異常。有研究顯示，乙醇主要通過抑制中樞信號分子SIRT1來影響脂質(zhì)代謝[35]，SIRT1的主要功能是對脂質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子(如FOXO基因家族)進行去乙?；揎?，使轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合更加緊密，促進

DNA的轉(zhuǎn)錄，參與脂質(zhì)代謝。因此，miRNAs可通過調(diào)控SIRT1脂質(zhì)代謝信號通路中重要的靶基因，如脂素-1(Lipin-1)、SREBP-1、PPARα、PPARγ共激活劑-1α(PPARγ co-activator-1α，PCG-1α)等，在AFLD的形成中發(fā)揮重要作用。

2.1.1 miR-217、miR-203靶向作用于Lipin-1而調(diào)節(jié)脂肪氧化合成 Lipin-1在脂質(zhì)代謝中具有雙重功能，在細胞質(zhì)中調(diào)節(jié)三酰甘油合成，同時在細胞核中能夠調(diào)節(jié)肝臟的脂肪酸氧化能力及脂肪生成酶的活性[36-37]。之前有研究者通過建立體外肝細胞乙醇培養(yǎng)模型及乙醇喂養(yǎng)的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)miR-217水平隨著乙醇濃度增加而上升，且過表達的miR-217可下調(diào)SIRT1基因的表達，明顯提高轉(zhuǎn)錄因子Lipin-1的表達水平，促進脂肪的積累[14]。然而在小鼠體內(nèi)，miR-203的高表達可靶向抑制Lipin-1的表達，從而減輕脂肪的積累[15]。

2.1.2 miR-24通過SIRT1/SREBP-1途徑參與脂質(zhì)代謝 在肝細胞中，乙醇可通過SIRT1信號通路誘導(dǎo)SREBP-1去乙?；瑥亩种芐REBP-1基因表達，導(dǎo)致膽固醇合成酶及三酰甘油合成酶的激活受阻[38]。有實驗通過乙醇喂養(yǎng)小鼠發(fā)現(xiàn)，miR-24的低表達可以引起SIRT1的上調(diào)，進而抑制SREBP-1的表達，最終導(dǎo)致脂肪積累[16,39]。在NAFLD中，許多miRNAs被證實參與了SREBP-1調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的過程[16]，但在AFLD中，仍需要不斷地研究、發(fā)掘miRNAs參與SREBP-1調(diào)節(jié)的機制。

2.1.3 miR-34a、miR-27a通過抑制PPARα的表達調(diào)節(jié)脂質(zhì)氧化代謝 PPARα信號通路在AFLD脂質(zhì)氧化代謝中也起著重要的作用。在乙醇的誘導(dǎo)下，PPARα可通過脂肪酸β氧化、三羧酸循環(huán)及電子轉(zhuǎn)移鏈三條途徑增強線粒體中的氧化代謝反應(yīng)，調(diào)節(jié)AFLD脂質(zhì)代謝[40]。同時生物鐘基因BMAL1增強肝細胞的抗乙醇損傷能力也與PPARα介導(dǎo)的脂肪氧化有關(guān)[41]。實驗研究證實，miR-34a、miR-27a可以通過抑制靶基因PPARα的表達來調(diào)節(jié)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運與代謝[17-18]。

2.2 miRNAs參與細胞免疫炎癥反應(yīng)促進AFLD形成 在肝臟中存在許多天然免疫細胞，包括單核巨噬細胞及庫普弗細胞等，形成了天然的免疫防御屏障，乙醇可通過激活免疫細胞介導(dǎo)的細胞炎癥反應(yīng)促進AFLD的形成。在乙醇誘導(dǎo)的致敏反應(yīng)中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)起著關(guān)鍵作用，可與肝組織細胞及庫普弗細胞表達的Toll樣受體信號(toll-like receptors，TLRs)結(jié)合，激活炎癥反應(yīng)途徑，產(chǎn)生炎性細胞因子(如NF-κB)、補體等，同時還可通過AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)等信號通路促進AFLD的形成[42-44]。

2.2.1 miRNAs調(diào)控巨噬細胞與單核細胞活化在AFLD中，巨噬細胞與單核細胞在促進細胞炎癥中發(fā)揮著重要作用。巨噬細胞中TLRs可誘導(dǎo)miR-155、miR-9、let-7c等靶向作用于編碼關(guān)鍵分子的

mRNAs，參與調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化[20-21]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在AFLD中還可通過參與巨噬細胞自噬活動及外泌體分泌來誘導(dǎo)細胞炎癥[45]。同時在單核細胞中，miR-27a通過下調(diào)EPK信號通路抑制快速發(fā)育生長因子同源蛋白2(sprouty2)蛋白的表達，增加白細胞介素(IL)-10的分泌，促進乙醇誘導(dǎo)單核細胞活化與極化的過程[22]。

2.2.2 miR-148a、miR-122、miR-223參與炎性因子的調(diào)節(jié) 在肝細胞中，miRNAs可通過AFLD中重要的炎性基因來發(fā)揮作用，如FOXO1、粒狀頭樣2(grainyhead like2，GRHL2)。乙醇可抑制肝細胞中炎性基因FOXO1以促進miR-148a高表達，導(dǎo)致肝細胞發(fā)生炎性萎縮[23]。與非乙醇喂養(yǎng)的對照小鼠相比，乙醇喂養(yǎng)小鼠的炎性因子GRHL2表達水平明顯上升，抑制了miR-122的表達，減輕了肝細胞的炎癥反應(yīng)[24]，另一項研究證實miR-223可通過抑制中性粒細胞IL-6-p47phox-氧化應(yīng)激途徑而明顯減輕小鼠的酒精性肝損傷[25]。

2.2.3 miR-497、miR-182調(diào)節(jié)膽汁酸代謝 膽汁酸代謝異常也是引起AFLD炎癥反應(yīng)的因素之一。小鼠模型證實miR-497可抑制CB1R-BTG2-YY1信號通路中基因的表達，引起膽汁酸的異常代謝[26,46]。此外，在酒精肝細胞中miR-182表達明顯異常，經(jīng)過整合分析發(fā)現(xiàn)，miR-182高表達能刺激膽汁淤積，引起肝臟炎性變化，促進AFLD的形成[27]。

2.3 miRNAs參與其他路徑促進AFLD形成 長期飲酒不僅能直接引起肝臟脂質(zhì)代謝異常及炎性變化，還能通過其他途徑促進AFLD的形成。在乙醇的刺激誘導(dǎo)下，腸上皮細胞可通過表達miR-212抑制閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens protein 1，ZO-1)的表達，導(dǎo)致腸道對LPS等炎性物質(zhì)的通透性增加，最后經(jīng)門靜脈到達肝臟，激活免疫信號通路[28,42]。長期飲酒還會限制肝臟脂肪酸氧化途徑中的關(guān)鍵酶AMPK的活性，進而影響AFLD的形成。研究表明，AMPK可通過影響其下游元件的活性，刺激miR-15a、miR-128及miR-192的表達，介導(dǎo)細胞的衰老及凋亡[29]。同時AMPK還能調(diào)節(jié)miR-184的表達而影響胰島細胞的功能，間接影響脂質(zhì)的積累[10,30]。另一項研究顯示，在乙醇代謝中，miR-214-3p能夠抑制細胞色素P450 2E1 (CYP2E1)的表達，產(chǎn)生活性氧、乙醛等物質(zhì)引起細胞炎性損傷[31]。同時長期飲酒使肝損傷后的肝細胞增殖再生能力減弱，這也是促進AFLD發(fā)展的潛在因素[28]。在對乙醇喂養(yǎng)小鼠進行肝部分切除術(shù)的實驗中發(fā)現(xiàn)，抑制肝細胞內(nèi)miR-21的水平能夠有效加強肝細胞的再生能力[32]，這或許是一種新的改善AFLD的途徑。

總之，目前大多數(shù)研究主要是通過構(gòu)建實驗動物模型或體外細胞實驗闡釋miRNAs與AFLD形成的關(guān)系，這些體外細胞培養(yǎng)及動物模型與人體組織細胞存在較大差異，不能真實反映體內(nèi)的變化，但可以證實其作用機制，為今后的相關(guān)實驗及治療提供參考。因此，對于miRNAs參與AFLD形成機制的研究，需要更多基因組及蛋白質(zhì)組學(xué)分析闡釋miRNAs與下游因子調(diào)控作用的具體機制，完善miRNAs與靶基因作用的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，再結(jié)合臨床試驗研究，最終使miRNAs靶向治療成為現(xiàn)實。