HMGB1與重癥中暑大鼠凝血紊亂的相關(guān)性分析

余保軍，王黎，彭娜，施學(xué)智，陸勇，梁泳欣，童華生*，蘇磊*

1南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東深圳 518101；2解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科/全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510010

重癥中暑(severe heatstroke)是由熱暴露導(dǎo)致的一種重癥疾病，常并發(fā)凝血紊亂，最終導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，病死率高達(dá)40%～70%[1]。凝血紊亂對重癥中暑預(yù)后具有重要的預(yù)測價(jià)值[2-3]，在重癥中暑發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年來，細(xì)胞外高遷移率族蛋白B1(high-mobility group protein B1，HMGB1)作為一種重要的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)分子，在重癥中暑中的作用越來越受到重視[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可作用于多種細(xì)胞受體并促進(jìn)細(xì)胞分泌炎性因子，加快炎癥進(jìn)展，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷、激活凝血，還可作用于細(xì)胞受體直接促使血管內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌啟動外源性凝血途徑的組織因子(tissue factor，TF)[7]，提示HMGB1在重癥中暑凝血紊亂中起重要作用。本研究探討了HMGB1與重癥中暑大鼠凝血紊亂的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究HMGB1參與重癥中暑凝血紊亂的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)檢測試劑盒(法國Stago公司)；HMGB1、凝血酶抗凝血酶復(fù)合物(TAT) ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。高溫氣候人工培養(yǎng)箱(寧波戴維醫(yī)療器械股份有限公司)；STA全自動凝血檢測儀(法國Stago公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠48只，體重265～290 g，由南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物中心飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)動物的相關(guān)方案通過實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 采用高溫氣候人工培養(yǎng)箱建立重癥中暑大鼠模型。將48只SD大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假加熱正常對照組(Sham組)和重癥中暑復(fù)溫0 h組(HS-0 h組)、3 h組(HS-3 h組)、6 h組(HS-6 h組)、9 h組(HS-9 h組)、12 h組(HS-12 h組)、18 h組(HS-18 h組)、24 h組(HS-24 h組)，每組6只。Sham組大鼠置于溫度(25.0±0.5) ℃、濕度50%±5%環(huán)境中；重癥中暑組大鼠置于高溫氣候人工培養(yǎng)箱中[溫度(39.5±0.2) ℃，濕度60%±5%]，禁食禁水，每10 min經(jīng)直腸測核心體溫(core body temperature，Tc)，Tc達(dá)43 ℃即判定為重癥中暑[5]，中暑發(fā)生后立即將大鼠移出培養(yǎng)箱，自由進(jìn)食進(jìn)水，放回原飼養(yǎng)環(huán)境。制模前后稱重，并記錄熱暴露時(shí)間。Sham組大鼠接受相同處理，不接受熱打擊。

1.3.2 血液標(biāo)本采集 腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，分離右側(cè)頸總動脈，置入6 cm PE50導(dǎo)管，EDTA抗凝管采血1 ml送檢血小板計(jì)數(shù)(platelet，PLT)，枸櫞酸鈉抗凝管采血3管，每管2 ml，1管送檢常規(guī)凝血指標(biāo)，其余2管4 ℃、1500 r/min離心10 min，分離血漿，分裝后-80 ℃保存，集中檢測。

1.3.3 PLT檢測 采血后1 h內(nèi)送南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，使用自動血液細(xì)胞分析儀檢測。

1.3.4 PT、APTT、TT及Fib檢測 采用凝固法檢測PT、APTT、TT、Fib。采血后1 h內(nèi)送南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，使用STA全自動凝血檢測儀檢測。

1.3.5 HMGB1及TAT水平檢測 ELISA法檢測HMGB1及TAT水平。按照ELISA檢測試劑盒的說明書步驟，使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的光密度(OD)值，計(jì)算靶蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0和Empower (R)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；相關(guān)分析采用廣義相加模型(generalized additive model，GAM)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 中暑前后大鼠體重和核心體溫變化情況 重癥中暑大鼠建模前后體重及核心體溫變化情況見表1。建模前，Sham組與中暑組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.5)。建模后，中暑組大鼠體重較建模前明顯降低[下降(26.48±5.38) g，P＜0.05]，而Sham組大鼠體重下降不明顯，兩組體重變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與Sham組比較，中暑組大鼠建模后的核心體溫變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

2.2 中暑后大鼠常規(guī)凝血指標(biāo)動態(tài)變化情況 大鼠中暑后PT延長。與Sham組比較，中暑后3 h、12 h PT延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.001)；中暑后18 h、24 h PT仍延長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1A)。大鼠中暑后APTT延長。與Sham組比較，中暑即刻及3 h APTT延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；中暑后12 h APTT達(dá)高峰(P＜0.001，圖1B)。與Sham組比較，大鼠中暑即刻TT延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；中暑后9 h、12 h TT明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，圖1C)。大鼠中暑后Fib水平逐漸升高，中暑后18 h達(dá)高峰(P＜0.001，圖1D)。PLT在大鼠中暑后3 h開始逐漸減少。與Sham組比較，中暑后6 h PLT減少(P＜0.05)；中暑后9 h、12 h、18 h和24 h PLT明顯減少(P＜0.01，P＜0.001，圖1E)。

表1 建模前后大鼠體重及核心體溫變化情況()Tab.1 Changes of rat's body weight and core temperature before and after modeling ()

表1 建模前后大鼠體重及核心體溫變化情況()Tab.1 Changes of rat's body weight and core temperature before and after modeling ()

Tc.核心體溫

項(xiàng)目 Sham組(n=6) 重癥中暑組(n=42) P體重(g)建模前 271.83±13.30 272.22±19.22 0.993建模后 266.17±13.98 245.29±19.61 0.016體重變化 5.67±2.25 26.48±5.38 0.000熱暴露時(shí)間(min) 0 170.50±8.01 0.000 Tc(℃)建模前 36.67±0.26 36.62±0.28 0.697建模后 36.76±0.23 43.00±0.00 0.000 Tc變化 0.10±0.35 6.38±0.28 0.000

2.3 中暑后大鼠血漿TAT及HMGB1水平的動態(tài)變化 大鼠血漿TAT水平于中暑后3 h開始升高，與Sham組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；中暑后9 h及12 h TAT水平明顯升高(P＜0.001)，且在中暑后12 h達(dá)高峰(圖2A)。中暑后，大鼠血漿HMGB1水平逐漸升高。與Sham組比較，中暑后3 h、6 h、9 h、12 h HMGB1水平明顯升高(P＜0.001)，中暑后18 h及24 h HMGB1水平仍高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，圖2B)。

2.4 中暑后大鼠血漿HMGB1與各凝血指標(biāo)的相關(guān)性 廣義相加模型分析結(jié)果顯示，HMGB1與PT、TAT均呈線性關(guān)系且明顯相關(guān)(P＜0.05，P＜0.0001，圖3A、E)；HMGB1與APTT、TT均呈線性關(guān)系，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.058，P=0.096，圖3B、C)；HMGB1與PLT呈非線性關(guān)系，但明顯相關(guān)(P＜0.001，圖3D)；HMGB1與Fib無關(guān)(P＞0.05)。

3 討 論

中暑并發(fā)的凝血功能紊亂一直是中暑的熱點(diǎn)話題[8]，且是中暑預(yù)后的一個(gè)重要評估指標(biāo)[2-3,9]，可能是將來改善中暑預(yù)后的一個(gè)治療靶點(diǎn)，但目前中暑引發(fā)機(jī)體凝血功能紊亂的機(jī)制尚未明確。

圖1 各組大鼠常規(guī)凝血指標(biāo)動態(tài)變化比較Fig.1 Comparison of PT, APTT, TT, Fib and PLT in rats of every group

圖2 各組大鼠血漿TAT及HMGB1水平比較Fig.2 Comparison of blood plasma concentration of TAT and HMGB1 in rats of every group

圖3 HMGB1與各凝血指標(biāo)的相關(guān)性Fig.3 Association between HMGB1 and other coagulation parameters

本研究結(jié)果顯示，大鼠中暑后24 h內(nèi)PT、APTT、TT延長，PLT進(jìn)行性減少，F(xiàn)ib水平升高，TAT(表示體內(nèi)凝血酶激活程度)水平明顯升高，說明中暑大鼠發(fā)生凝血功能紊亂。大鼠中暑即刻TT明顯延長，是中暑大鼠最早出現(xiàn)異常的凝血指標(biāo)。TT可反映加入足夠外源性凝血酶后，將血漿Fib轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白所需的時(shí)間。TT延長提示：①血漿Fib出現(xiàn)異常，一方面可能是Fib水平降低；另一方面也可能是Fib水平未降低，但質(zhì)量出現(xiàn)異常或是出現(xiàn)能與Fib結(jié)合的異常物質(zhì)。②Fib未出現(xiàn)異常，但機(jī)體血漿中出現(xiàn)大量抗凝血酶物質(zhì)導(dǎo)致凝血酶不能作用于Fib。Fib檢測結(jié)果顯示，中暑即刻(HS-0 h組)Fib水平未降低，推測TT延長可能是由于中暑后血漿中出現(xiàn)大量抗凝血酶物質(zhì)，也可能是血漿中Fib由于熱打擊導(dǎo)致質(zhì)量改變或出現(xiàn)與Fib結(jié)合的異常物質(zhì)。同時(shí)結(jié)合PT及APTT檢測結(jié)果(中暑即刻APTT延長，PT未延長)，推測Fib本身出現(xiàn)異常的可能性較小，原因?yàn)槿鏔ib出現(xiàn)異常，則PT和APTT均應(yīng)延長。由此可見，大鼠中暑后血漿中即刻出現(xiàn)大量抗凝血酶物質(zhì)導(dǎo)致TT和APTT延長，這與在應(yīng)用肝素抗凝時(shí)觀察到的凝血指標(biāo)改變類似[10]。以上推測在Bouchama等[11]的研究中得到證實(shí)，即狒狒中暑即刻，血漿抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ，ATⅢ)活性較Sham組升高，但在3 h后進(jìn)行性下降。本研究結(jié)果顯示，中暑3 h后，大鼠TAT水平呈進(jìn)行性升高，PLT進(jìn)行性減少，PT、APTT均在3 h后延長、12 h達(dá)到高峰，TT在12 h延長并達(dá)到峰值。提示中暑后3 h內(nèi)，機(jī)體內(nèi)存在的保護(hù)性抗凝物質(zhì)增多，抗凝及促凝平衡向抗凝傾斜，檢測指標(biāo)表現(xiàn)的低凝為抗凝物質(zhì)導(dǎo)致的低凝；3 h后，抗凝物質(zhì)減少，體內(nèi)抗凝及促凝平衡向促凝傾斜，TAT升高代表體內(nèi)凝血激活，導(dǎo)致凝血因子及血小板消耗致消耗性低凝，檢測指標(biāo)表現(xiàn)的低凝為消耗性低凝。雖然如此，但檢測發(fā)現(xiàn)血漿Fib水平并未進(jìn)行性減低，考慮是由于Fib是一種急性反應(yīng)蛋白，在發(fā)生炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷、應(yīng)激時(shí)會升高，而熱打擊可引起機(jī)體創(chuàng)傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，因此中暑后大鼠血漿Fib水平升高是機(jī)體對熱應(yīng)激的反應(yīng)，結(jié)合中暑后12 h TT延長，提示Fib存在功能異?；蜓獫{中存在與Fib大量結(jié)合的物質(zhì)[12]。

HMGB1早期是作為晚期炎性介質(zhì)參與膿毒癥發(fā)病被發(fā)現(xiàn)的，是內(nèi)毒素致死效應(yīng)的重要晚期因子，抑制HMGB1活性或分泌可減少大鼠重癥膿毒癥和多臟器衰竭(MOF)的發(fā)生[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，血漿HMGB1水平在中暑即刻顯著升高并可長時(shí)間維持，從而發(fā)揮早期啟動并動態(tài)維持炎癥效應(yīng)的功能，可作為中暑預(yù)后不良的預(yù)測指標(biāo)[6,14]。本研究顯示，與Sham組相比，大鼠中暑即刻HMGB1水平升高，3 h顯著升高，12 h達(dá)高峰，24 h仍高于對照組。由于HMGB1可作用于多種細(xì)胞受體[包括晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end-products，RAGE)、Toll樣受體(TLR2、TLR4、TLR9)]發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，直接促使血管內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌炎性因子并激活外源性凝血途徑的組織因子(TF)[7]，因此，HMGB1可通過炎癥途徑和外源性凝血途徑激活機(jī)體凝血，從而導(dǎo)致中暑凝血紊亂。本研究中曲線擬合相關(guān)分析結(jié)果顯示，HMGB1與凝血相關(guān)指標(biāo)PT、PLT、TAT明顯相關(guān)，尤其與TAT存在明顯的線性相關(guān)。基于HMGB1在中暑后水平升高并長時(shí)間維持高水平，可直接刺激細(xì)胞TF合成，以及促進(jìn)炎性因子釋放的特點(diǎn)，且HGMB1與大鼠中暑后凝血紊亂指標(biāo)明顯相關(guān)，提示HMGB1在重癥中暑大鼠凝血紊亂中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，HMGB1與重癥中暑大鼠凝血紊亂明顯相關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。