CD44和RHAMM在胃腸腫瘤中的表達(dá)及其臨床意義

王建芳 康 樂(lè) 宋紅杰

細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)及其他細(xì)胞相互作用完成了腫瘤的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散[1]。在細(xì)胞外基質(zhì)中，透明質(zhì)酸是主要構(gòu)成成分，在細(xì)胞基本行為中發(fā)揮著極為重要的作用，如細(xì)胞粘附、分化等，同時(shí)在腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移中參與[2]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44和RHAMM在胃腸腫瘤中的表達(dá)，并對(duì)其與臨床特征及預(yù)后進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2017年6月至2019年5月我院胃腸腫瘤患者95例，其中男性63例，女性32例，年齡32～85歲，平均(58.6±10.2)歲。在病理分級(jí)方面，65例為Ⅱ級(jí)，30例為Ⅲ級(jí)；在腫瘤部位方面，57例為腸道，38例為胃部；在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，33例有轉(zhuǎn)移，62例無(wú)轉(zhuǎn)移。將腫瘤組織及其周邊5 cm以上的正常組織取出來(lái)，保存在液氮中。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理類型均為腺癌；②均知情同意。排除術(shù)前接受過(guò)放化療，依從性較差的患者。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑 購(gòu)買Invitrogen life technologies公司生產(chǎn)的 Trizol試劑，寶生物工程大連有限公司生產(chǎn)的BIO BASIC INC焦炭酸二乙酯、SYBR real time PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD-19載體連接試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司生產(chǎn)的PCR試劑盒，并由其合成PCR引物，上海超世生物有限公司合成實(shí)時(shí)PCR引物，北京天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DNA凝膠回收試劑盒、Top10細(xì)菌細(xì)胞，臺(tái)灣旭基生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒抽提試劑盒。

1.3.2 總RNA抽提與cDNA合成 將50 mg組織取出來(lái)，應(yīng)用Trizol試劑，運(yùn)用一步法將總RNA提取出來(lái)，采用德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì)對(duì)純度、含量進(jìn)行檢測(cè)，然后將1 μg總RNA取出來(lái)，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將qDNA制備出來(lái)。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 采用德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)的PCR擴(kuò)增儀，反應(yīng)體系為5 μl反應(yīng)緩沖液+5 μl 2 mmol/l dNTP混合液+1.5 μl 20 μmol/l上游引物+1.5 μl 20 μmol/l下游引物(表1)+0.2 μl 5 U/μl Taq酶+2 μl 25 mmol/l MgCl2+2 μl cDNA=50 μl。反應(yīng)條件為在94 ℃、94 ℃、58 ℃、72 ℃的溫度下分別進(jìn)行3 min的預(yù)變性、1 min、30 s、1 min的變性，共30個(gè)循環(huán)，然后在72 ℃的溫度下延長(zhǎng)5 min。保存在4 ℃的溫度下。12 g/l瓊脂糖電泳后用英國(guó)SYSGENE公司生產(chǎn)的Bio imaging system拍攝，CD44、RHAMM、三磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)擴(kuò)增片段分別為463 bp、477 bp、571 bp。見表1。

表1 普通PCR引物序列[3]

1.3.4 CD44、透明質(zhì)酸介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)受體(RHAMM) GAPDH質(zhì)粒制備 用pMD-19載體連接上述3種擴(kuò)增片段，向Top10感受態(tài)細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)化入連接產(chǎn)物，在LB平板(含x-gal/IPTG與氨芐青霉素)上涂布。在37 ℃的溫度下進(jìn)行12～16 h的培養(yǎng)，然后將單個(gè)白色菌落挑取出來(lái)，在3 ml LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)上接種，在35 ℃的溫度下過(guò)夜，將速率設(shè)定為20 r/min。對(duì)菌液A600 nm值進(jìn)行測(cè)定，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液取出來(lái)，抽提質(zhì)粒。測(cè)序核實(shí)抽提的質(zhì)粒，將其設(shè)定為實(shí)時(shí)PCR標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.5 實(shí)時(shí)PCR 將純化的CD44、RHAMM GAPDH質(zhì)粒取出來(lái)，應(yīng)用easy dilution試劑(SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒)稀釋成101、102、103、104、105、106、107、108拷貝數(shù)/μl，采用Roche公司生產(chǎn)的Lightcycler熒光定量PCR儀，反應(yīng)體系為10 μl SYBR R PremixExTaqTM+0.4 μl 10 μmol/l上游引物+0.4 μl 10 μmol/l下游引物(表2)+2 μl模板cDNA+7.2 μl雙蒸水(ddH2O)，反應(yīng)條件為在95 ℃、20 ℃的溫度下進(jìn)行10 s、20 s的預(yù)變性，在95 ℃的溫度下進(jìn)行5 s的變性，在60 ℃的溫度下進(jìn)行20 s的單點(diǎn)(single)，共45個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)。在95 ℃、65 ℃、20 ℃、95 ℃的溫度下分別進(jìn)行20 s、15 s、20 s、10 s的連續(xù)(continue)，分析溶解曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為質(zhì)粒的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。依據(jù)各樣品的熒光值將標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的起始拷貝數(shù)讀取出來(lái)，所有樣品均做復(fù)管，對(duì)目的基因、管家基因GAPDH進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增。見表2。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44在胃腸腫瘤中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44在胃腸腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常組織(P<0.05)，其中腸道、胃部、有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織的CD44表達(dá)均顯著高于正常組織(P<0.05)；腸道的腫瘤組織、正常組織CD44表達(dá)均顯著高于胃部(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織、正常組織CD44表達(dá)均顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)。見表3。

表2 實(shí)時(shí)PCR引物序列[4]

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44在胃腸腫瘤的表達(dá)

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RHAMM在胃腸腫瘤中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RHAMM在胃腸腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常組織(P<0.05)，其中腸道、有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織RHAMM表達(dá)均顯著高于正常組織(P<0.05)，但胃部的腫瘤組織和正常組織的RHAMM表達(dá)之間的差異不顯著(P>0.05)；腸道的腫瘤組織、正常組織RHAMM表達(dá)均顯著高于胃部(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織、正常組織的RHAMM表達(dá)均顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)。見表4。

表4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RHAMM在胃腸腫瘤中的表達(dá)

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44和RHAMM在胃腸腫瘤中的表達(dá)相關(guān)性

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44與RHAMM在胃腸腫瘤中的表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.05)，其中腸道、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CD44和RHAMM均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，但胃部、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CD44和RHAMM均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見表5。

表5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44和RHAMM在胃腸腫瘤的表達(dá)相關(guān)性

3 討論

CD44是一種歸巢受體，屬于一種跨膜蛋白，在炎性細(xì)胞的激活、游走等中參與，同時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行介導(dǎo)，使其和血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，從血管壁穿過(guò)，向淋巴組織返回。此外，其還能夠結(jié)合細(xì)胞骨架蛋白，在細(xì)胞的偽足形成中參與，和細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)相關(guān)，通過(guò)和透明質(zhì)酸相互作用，為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供良好的前提條件[5-8]。多種腫瘤均能夠?qū)D44進(jìn)行表達(dá)，尤其是具有較高的惡性程度、有轉(zhuǎn)移灶的腫瘤，且在血清中出現(xiàn)。通常情況下，如果腫瘤具有較低的惡性程度或轉(zhuǎn)移能力，那么其就不對(duì)CD44進(jìn)行表達(dá)[9]。腫瘤侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)展、手術(shù)預(yù)后均和CD44表達(dá)相關(guān)[10]。RHAMM也屬于一種透明質(zhì)酸粘附受體，在一些腫瘤細(xì)胞、多種正常細(xì)胞中表達(dá)。RHAMM一方面是細(xì)胞內(nèi)的透明質(zhì)酸受體，另一方面還是細(xì)胞外表面受體，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等中均發(fā)揮著極為重要的作用[11-13]。本研究結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44在胃腸腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常組織。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RHAMM在胃腸腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常組織。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44和RHAMM在胃腸腫瘤中的表達(dá)顯著相關(guān)，其中腸道、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CD44和RHAMM均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，但胃部、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CD44和RHAMM均無(wú)相關(guān)性，和相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致[14-15]。

總之，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CD44和RHAMM在胃腸腫瘤組織中的表達(dá)均高于正常組織，且具有相關(guān)性，能夠?qū)δ[瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行判定參考。