瓊脂微球偶聯(lián)氨基化合物及其效果分析

冶昡青，杜江龍，劉振斌，喬自林，馮玉萍

(西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030)

微載體是一類無毒性、非剛性、密度均一的高分子微球.微載體培養(yǎng)技術(shù)首先由WEZEL[1-3]等于1967年提出，經(jīng)過近半個世紀(jì)的發(fā)展，目前已成為生物醫(yī)藥制品領(lǐng)域主導(dǎo)的生產(chǎn)方法.在國內(nèi)，微載體培養(yǎng)技術(shù)相對滯后，主要原因是培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器和微載體三方面都依賴于進(jìn)口.瓊脂是由瓊脂糖和硫瓊膠組成的無特異性的吸附蛋白，是理化性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好的高分子聚合物[4-8]，將瓊脂固化交聯(lián)制備后精確篩選大小得到瓊脂微球.在微球表面引入一些親和性配基后，將此瓊脂微球用作親和層析介質(zhì)，一方面保證了純植物源性生物材料作為原料，另一方面又解決了瓊脂糖原料昂貴的問題[9]. 口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot And Mouthdisease Virus,FMDV)感染而引起的偶蹄動物共患的急性發(fā)熱性傳染疾病，它有畜牧業(yè)“頭號殺手”的稱號，故而口蹄疫的防治始終受到世界各國的重視[10-12].目前，口蹄疫滅活疫苗的接種是預(yù)防和控制口蹄疫發(fā)生并流行的最主要方法.通過采用純化技術(shù)，分離與純化疫苗的免疫活性成分，去除其他生物源性雜質(zhì)成分，能夠較好地降低或避免疫苗接種后發(fā)生副反應(yīng)，從而大大增加了病毒疫苗的安全性.馬全英[13]等人利用離子交換層析法，分離純化了口蹄疫病毒抗原,結(jié)果表明.在一定條件下，利用陰離子交換樹脂可以制備出高純度的FMDV抗原[8]. 親和層析，是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，從而使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法[14-16].親和層析介質(zhì)具有較大的載量，較強(qiáng)的分離性和較高的選擇性，可使待分離的生物大分子，從復(fù)雜的混合物中分離出來,達(dá)到千倍以上的純化,又能保持較高的活性[17-19].親和層析技術(shù)是分離純化和分析病毒、抗原、抗體、細(xì)胞、細(xì)胞器、激素、抑制劑、糖蛋白、結(jié)合蛋白、酶、核酸等生物大分子的有力工具[20,21]. 本文以自制陰離子交換劑瓊脂微球為分離純化用介質(zhì)，設(shè)計正交試驗.在不同條件下，給瓊脂微球表面偶聯(lián)氨基，用凱氏定氮法測定含氮量，篩選出偶聯(lián)效果最佳的分離純化介質(zhì)，并利用該介質(zhì)分離純化口蹄疫滅活病毒抗原，檢測其分離純化效果.其目的是在初步探究瓊脂微球最優(yōu)偶聯(lián)氨基化合物的反應(yīng)條件，以及該自制親和層析介質(zhì)在分離純化口蹄疫滅活病毒抗原方面的應(yīng)用效果.綜上所述，本實驗為進(jìn)一步研究開發(fā)瓊脂微球陰離子交換介質(zhì)在口蹄疫病毒抗原的分離純化中提供了一定的參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓊脂粉(上海山浦化工，分析純)，氫氧化鈉(煙臺市雙雙化工，分析純)，環(huán)氧氯丙烷(煙臺市雙雙化工，分析純)，99%B-苯乙胺(上海阿拉丁有限公司，分析純)，鹽酸(山東恒通化工股份有限公司，分析純)，硼酸(江西省南華貿(mào)易有限公司，分析純)，溴甲酚綠(天津市凱信化學(xué)有限公司，分析純)，甲基紅(天津市凱信化學(xué)有限公司，分析純)，TRIS(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，分析純)，試驗用水為去離子水.

電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，HJ-6A多頭加熱磁力攪拌器(常州國華電器有限公司)，全自動凱氏定氮儀(丹麥福斯公司)，循環(huán)水式多用真空泵SHZ-95B型(上海耀特儀器設(shè)備有限公司)，AKTA PURIFIER蛋白純化儀(GE HEALTHCARE公司)，酸度計SG-2型(梅特勒-托利多儀器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 瓊脂微球的制備

準(zhǔn)確配制4%的瓊脂溶液[18]作為水相.按照100∶1的體積比配制環(huán)己烷和司盤-80的混合溶液作為油相，在攪拌的條件下,將水相緩慢地倒入油相,保溫乳化一段時間后降至室溫,停止攪拌,洗滌[19].

1.2.2 瓊脂微球的交聯(lián)固化

用75 μm和100 μm的銅篩篩選出大小75 μm～100 μm的瓊脂微球，稱取該微球15 g，去離子水洗凈靜置濾干，微球中加入3 mol/L的NaOH溶液30 mL，再加入15 mL的環(huán)氧氯丙烷活化劑，保持一定速度，40 ℃恒溫攪拌3.5 h.

1.2.3 交聯(lián)瓊脂微球表面氨基的偶聯(lián)

取75 μm～100 μm交聯(lián)后抽干的瓊脂微球15 g，加入2 mol/L的NaOH溶液，再加入β-苯乙胺，攪拌狀態(tài)下加熱至50 ℃，反應(yīng)一段時間后依次用自來水、去離子水洗凈，于25%的乙醇溶液中，4 ℃保存瓊脂微球.為了確定偶聯(lián)氨基的最優(yōu)工藝，試驗設(shè)計了L9(34)正交試驗(見表1).試驗考察了苯乙胺的量，NaOH的量三個因素對偶聯(lián)效果的影響，采用凱氏定氮測得氮含量評價偶聯(lián)效果.

1.2.4 偶聯(lián)效果的檢測

稱取純水洗凈抽干的待測偶聯(lián)氨基的微載體各0.2 g，分別加入濃硫酸10 mL，催化劑(由0.1 g CuSO4·5H2O和1.5 g K2SO4制做而成)一片.將氫氧化鈉3.5 g，0.1%的溴甲酚綠40 μL，溶于50 mL去離子水，加入抽酸儀中(抽酸儀中的溶液呈現(xiàn)藍(lán)色后不再添加)420 ℃消化樣品1 h.待冷卻后凱氏定氮儀上分別蒸餾樣品，再用0.1 N-HCl滴定三角瓶內(nèi)樣液至其剛好變?yōu)闇\紫色，記錄消耗鹽酸用量，實驗組記為Tn，空白組中消耗鹽酸最少用量記為Dmin，計算總蛋白含量最高的一組樣品.

待測樣品含氮量：F(%)=(Tn-Dmin)×14.007×CHCl×100%/mn

待測樣品總蛋白含量：FN(%)=F(%)×6.25.

注：mn單位為mg

1.2.5 瓊脂微球?qū)谔阋卟《痉蛛x純化效果檢測

分別取洗凈抽干的藥廠口蹄疫病毒抗原分離純化介質(zhì)和偶聯(lián)氨基效果最佳的瓊脂微球各15 g，溶于10 mL去離子水，安裝于層析柱，平衡層析柱后啟動AKTA PURIFIER蛋白純化儀.取3 mL的口蹄疫滅活病毒抗原，上樣1 mL，10 mmol/mL、pH為8.0、含有0.15 M的NaCl的Tris-HCl洗脫液洗脫純化后的口蹄疫滅活病毒抗原，收集3 mL/管洗脫液.對口蹄疫滅活病毒抗原進(jìn)行分離純化，最終得到二者的層析柱效圖.對柱效圖所顯示的口蹄疫滅活病毒抗原洗脫峰的出峰時間、出峰高度和出峰面積進(jìn)行比較.

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 氨基偶聯(lián)結(jié)果

待測樣品含氮量F(%)=(Tn-Dmin)×14.007×CHCl×100%/mn

將各組實驗中的Tn、Dmin、mn值和CHCl代入式(3)得表2結(jié)果.

表2 正交試驗結(jié)果

對試驗結(jié)果中的R(極差)進(jìn)行比較表明：正交試驗中的三個主要因素對瓊脂微球含氮量的影響主次順序依次為A(苯乙胺的量)> C(偶聯(lián)時間)>B(NaOH的量).三個主要因素對瓊脂微球含氮量的影響均遠(yuǎn)大于實驗中隨機(jī)誤差(空列)的影響.

均值分析表明：活化后的瓊脂微球在20 mL 2 M的 NaOH水溶液，6 mL的苯乙胺，50 ℃偶聯(lián)反應(yīng)2.5 h的條件下，偶聯(lián)效果最佳，最優(yōu)偶聯(lián)條件下瓊脂微球介質(zhì)的含氮量為0.4486%.

2.2 分離純化口蹄疫病毒抗原的檢測結(jié)果及討論

圖1和圖2中的層析柱效圖，均裝于高4 cm，直徑2 cm的層析柱中，在AKTA purifier層析儀下分離純化樣液所得.樣液均為A藥廠提供的口蹄疫滅活病毒抗原，層析過程中樣液流速均為1 mL/min.

圖1A所用介質(zhì)，是A藥廠的介質(zhì)X，具體制備工藝及成分不明，用于分離純化口蹄疫滅活病毒抗原.該圖前兩個洗脫峰為雜蛋白的洗脫峰，出峰時間為第2.14 min和第5.11 min.最后一個洗脫峰為口蹄疫滅活病毒抗原的洗脫峰，出峰時間為第36.92 min，出峰高度為5.720 Mau，出峰面積為18.5259 Mau mL.

A：A藥廠口蹄疫滅活病毒抗原層析介質(zhì)柱效圖 B：本實驗室口蹄疫滅活病毒抗原層析介質(zhì)柱效圖

圖2 自制口蹄疫滅活病毒抗原層析介質(zhì)柱效圖

圖1B所用介質(zhì)，是本實驗室先前制備的用于分離純化口蹄疫滅活病毒抗原的層析介質(zhì)Z，所用材料與本次實驗相同，但實驗條件不同.用介質(zhì)Z親和層析口蹄疫滅活病毒抗原，得到第一個洗脫峰是雜蛋白的洗脫峰，出峰時間為第4.6 min.第二個洗脫峰為口蹄疫滅活病毒抗原的洗脫峰，出峰時間為15.89 min，出峰高度為8.399 Mau，出峰面積為15.2659 Mau mL.

圖2所用介質(zhì)，是本次實驗偶聯(lián)苯乙胺效果最佳的親和層析介質(zhì).用該介質(zhì)親和層析口蹄疫滅活病毒抗原，得到第一個洗脫峰是雜蛋白的洗脫峰，出峰時間為第5.15 min.第二個洗脫峰為口蹄疫滅活病毒抗原的洗脫峰，出峰時間為35.85 min，出峰高度為5.023 Mau，出峰面積為18.3672 Mau mL.

層析柱效圖和數(shù)據(jù)顯示,相對于本實驗室之前制備的分離純化口蹄疫滅活病毒抗原的介質(zhì)Z，本次實驗制備的介質(zhì)具有更長高度、更大面積的洗脫峰，在分離純化口蹄疫滅活病毒抗原方面具有更優(yōu)的層析效果.本次實驗制備的親和介質(zhì)在分離純化口蹄疫滅活病毒抗原時，抗原的出峰時間、出峰高度及出峰面積與A藥廠的層析介質(zhì)X的數(shù)據(jù)基本一致.結(jié)果表明，自制的該親和層析介質(zhì)對于口蹄疫滅活病毒抗原有較優(yōu)的分離純化效果.

3 結(jié)論

親和層析柱效結(jié)果表明，本研究最優(yōu)偶聯(lián)條件下，偶聯(lián)了苯乙胺的瓊脂微球介質(zhì)對口蹄疫滅活病毒抗原具有較好的分離純化作用,在口蹄疫滅活病毒抗原分離純化方面提供了一定的參考依據(jù).本研究中，瓊脂微球表面偶聯(lián)苯乙胺的最優(yōu)條件是：瓊脂微球15 g，濃度為3 M的NaOH水溶液30 mL，環(huán)氧氯丙烷15 mL，40 ℃活化反應(yīng)3.5 h；濃度2 M的NaOH水溶液20 mL，6 mL苯乙胺，50 ℃偶聯(lián)反應(yīng)2.5 h，測得該微球的含氮量是0.4486%.