巖果止咳液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)

呂情花

（湖南省婁底市食品藥品檢驗(yàn)檢測所，湖南 婁底417000）

巖果止咳液是由石吊蘭、果上葉、甘草流浸膏制成的純中藥制劑，具有清熱化痰、止咳潤肺的功效，用于治療急、慢性支氣管炎，咳嗽痰多的呼吸道疾病?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十九冊）》（WS3-B-3610-98），但只有1個(gè)化學(xué)鑒別、石吊蘭的薄層色譜（TLC）鑒別和制劑通則常規(guī)檢查項(xiàng)。本試驗(yàn)中增加了具有潤肺止咳、解毒消腫功效的果上葉的TLC鑒別法[1-2]，以有抗菌抗炎、化痰止咳等作用的石吊蘭中石吊蘭素[3-4]及有抗炎抗過敏等作用的甘草中甘草酸銨[5-6]作為指標(biāo)成分進(jìn)行定量測定，用高效液相色譜-紫外檢測（HPLC-UV）法同時(shí)測定二者含量，旨在更好地控制巖果止咳液的質(zhì)量，完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CAMAGⅢ型薄層掃描儀（瑞士Canag公司，配置半自動(dòng)點(diǎn)樣）；Waters e2695型高效液相色譜儀（配置2998二極管陣列紫外檢測器、控溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower色譜工作站，美國Waters公司）；AUW220D型電子天平（日本島津公司，精度為十萬分之一）；KQ5200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

果上葉對照藥材（批號為110726-201014），石吊蘭素對照品（批號為111555-200602，含量98.1%），甘草酸銨對照品（批號為110731-201720，含量97.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；巖果止咳液（貴州光正制藥有限公司，批號分別為HAE0928，HAE1020，HAE1228）；硅膠G板（青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司）；甲醇為色譜純（德國Merck公司）；Ⅰ級純化水（自制）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 果上葉TLC鑒別[7-8]

取本品10 mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)訜o水乙醇2mL使溶解，即得供試品溶液。取果上葉對照藥材3g，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液回收溶劑至干，殘?jiān)訜o水乙醇2 mL使溶解，即得對照藥材溶液。取缺果上葉的陰性對照樣品10 mL，同法制成陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典》（通則0502）TLC法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲醇（1∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液，烘干，在日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，詳見圖1。

圖1 果上葉薄層色譜圖

2.2 石吊蘭素、甘草酸銨含量測定[9-14]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：GeminiC18110A柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸溶液（68∶32，V/V）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：250 nm。

圖2 高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

取石吊蘭素、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，置同一10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.243 3，1.140 mg/mL混合對照品貯備液。精密量取本品2 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方及制備工藝分別制備缺石吊蘭（石吊蘭素）和甘草流浸膏（甘草酸銨）的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：在擬訂色譜條件下，分別進(jìn)樣混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液，測定。結(jié)果石吊蘭素、甘草酸銨的保留時(shí)間與對照品一致，各色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，陰性對照品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處無相應(yīng)峰，陰性對照無干擾。詳見圖2。

線性關(guān)系考察：精密量取混合對照品貯備液（溶液Ⅰ）10 mL，用甲醇稀釋至100 mL（溶液Ⅱ）。在擬訂色譜條件下分別取溶液Ⅰ和Ⅱ各2，5，10 μL進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得石吊蘭素和甘草酸銨回歸方程分別為Y石=2.76×103X-5.60×104（r=0.999 9，n=6），Y甘=3.49×102X-1.02×104（r=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，石吊蘭素和甘草酸銨的質(zhì)量濃度分別在0.004 866～0.243 3 mg/mL和0.022 8～1.140 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一混合對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果石吊蘭素、甘草酸銨的峰面積的RSD分別為1.02%和0.87%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，在擬訂色譜條件下分別于0，2，6，12，18，24 h時(shí)進(jìn)樣10 μL。結(jié)果石吊蘭素、甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.22%和1.34%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為HAE1228）樣品，依法平行制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果石吊蘭素、甘草酸銨的平均含量分別為0.242，2.022 mg/mL，RSD分別為1.43%和1.36%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的同一批（批號為HAE1228）樣品9份，每份1.00 mL，置25 mL容量瓶中，分別加入石吊蘭素、甘草酸銨（130.92，1088.34μg/mL）混合對照品溶液1.1，1.9，2.6 mL，依法制備供試品溶液，使三者含量均約為已知樣品的60%，100%，140%，每個(gè)濃度平行3份，精密吸取10 μL，進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取3個(gè)批號的樣品，依法制備供試品溶液方法制備，每批平行3份，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定（mg/mL，n=3）

3 討論

展開劑選擇：果上葉的TLC鑒別過程中，參考文獻(xiàn)[3-4]，以三氯甲烷、乙酸乙酯提取，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2∶1，V/V/V）上層溶液、三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）、甲苯-甲醇（1∶1，V/V）為展開劑，發(fā)現(xiàn)以三氯甲烷提取，甲苯-甲醇（1∶1，V/V）分離度好，可有效降低邊緣效應(yīng)。同時(shí)，比較氨蒸氣熏、噴以5%三氯化鐵乙醇溶液、噴以1%鐵氰化鉀-1%三氯化鐵溶液（1∶1，V/V）混合溶液3種顯色方式，發(fā)現(xiàn)5%三氯化鐵乙醇溶液斑點(diǎn)顯色清晰，效果好。

流動(dòng)相選擇：在HPLC分析過程中，參考文獻(xiàn)[9-14]分別以甲醇-1%冰醋酸（68∶32，V/V）、甲醇-1%冰醋酸-0.2 mol/L醋酸銨溶液（67∶1∶32，V/V/V）、甲醇-0.05%磷酸（68∶32，V/V）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.05%磷酸（68∶32，V/V）進(jìn)行洗脫時(shí)，基線平穩(wěn)，目標(biāo)峰峰形良好，分離效果佳。

檢測波長選擇：將2種對照品溶液進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)石吊蘭素、甘草酸銨最大吸收波長為334 nm和250 nm。相同條件下，在250 nm波長處2種成分的吸收都很明顯，且陰性對照品溶液無雜峰干擾。綜合考慮靈敏度和專屬性，確定最佳檢測波長為250 nm。

巖果止咳液是傳統(tǒng)藥，療效可靠，使用廣泛。目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有TLC鑒別，故建立HPLC法對其活性成分進(jìn)行多組分定量測定，可更好地控制該制劑的質(zhì)量。該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。