超高效液相色譜法測定參杞通脈膠囊中人參皂苷Rg1、Re和Rb1含量

郭社民，馬向東，韋靈杰

（1.河南省濮陽市食品藥品檢驗檢測中心，河南 濮陽457000；2.河南省濮陽市中醫(yī)醫(yī)院，河南 濮陽457000）

參杞通脈膠囊[豫藥制字Z20120343（濮）]是濮陽市中醫(yī)醫(yī)院在臨床實踐基礎(chǔ)上總結(jié)研制的純中藥制劑，由人參、黃芪、枸杞子、當(dāng)歸、川芎、丹參、地龍、茯苓、桑白皮、香加皮等中藥組方，具有益氣養(yǎng)陰、活血利水功效，可用于氣虛血瘀所致心悸、胸痹、喘證、水腫、虛勞等癥。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有黃芪的薄層鑒別及顯微鑒別，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究中參考文獻(xiàn)[1-9]，建立了對方中主藥人參中的人參皂苷Rg1、Re和Rb1含量測定的超高效液相色譜（UPLC）法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity H Class型超高效液相色譜儀（美國沃特世公司），配Empower數(shù)據(jù)工作站；Sartorius CPA 225D型分析天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01mg）。

1.2 試藥

人參皂苷Rg1、Re和Rb1對照品（批號分別為110703-201832，110754-201827，110704-201827，純度分別為92.4%，93.4%，91.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；參杞通脈膠囊（批號分別為20180923，20181015，20181105，規(guī)格為每粒0.35 g）及陰性對照品均由濮陽市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供；乙腈為色譜純（美國Tedia公司）；水為一級水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～6.5 min時19%A，6.5～10.8 min時19%～29%A，10.8～13.8 min時29%A，13.8～20 min時29%～40%A）；流速：0.4 mL/min；柱溫：28℃；檢測波長：203 nm；進樣量：5 μL。在此色譜條件下，各待測成分峰形良好，分離度均大于1.5，理論板數(shù)按人參皂苷Rg1、Re和Rb1峰計均大于3 000。

圖1 超高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取人參皂苷Rg1對照品16.32 mg、Re對照品11.20 mg和Rb1對照品16.68 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密量取混合對照品貯備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加入三氯甲烷-乙醚（1∶1，V/V）適量，加熱回流2 h，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入具塞錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，回流提取2 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加水15 mL，溶解，用水飽和的正丁醇20，20，15 mL萃取3次，合并正丁醇萃取液，分別用氨試液、水飽和的正丁醇各40 mL洗滌，棄去洗滌液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：取不含人參藥材的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2項下3種溶液各5 μL，注入超高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果顯示，陰性對照無干擾。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系列混合對照品溶液。按擬訂色譜條件進樣測定，以進樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得人參皂苷Rg1、Re和Rb1回歸方程分別為YRg1=942 081X+726.1（r=0.999 5），YRe=893 530X-1 259.1（r=0.999 3），YRb1=728 564X-1 072.5（r=0.999 1）。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1、Re、Rb1進樣量分別在0.075 4～0.603 2 μg，0.052 3～0.418 4 μg，0.076 0～0.608 4 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液5 μL，按擬訂色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果人參皂苷Rg1、Re和Rb1峰面積的RSD分別為0.76%，0.95%，0.89%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為20180923）樣品，依法制備供試品溶液，室溫下分別于0，1，2，4，8，12 h時進樣5 μL測定。結(jié)果人參皂苷Rg1、Re和Rb1峰面積的RSD分別為1.41%，1.57%，1.60%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為20180923）樣品，依法制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果人參皂苷Rg1、Re和Rb1平均含量分別為0.613 7 mg/g，0.358 3 mg/g，0.628 6 mg/g，RSD分別為0.85%，1.25%，1.05%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入混合對照品貯備液1.0 mL，依法制備供試品溶液，并按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

取樣品（批號分別為20180923，20181015，20181105）適量，依法制備供試品溶液，分別取供試品溶液和對照品溶液按擬訂色譜條件進樣測定，以外標(biāo)法計算含量。結(jié)果每粒參杞通脈膠囊中含人參皂苷Rg10.214 8，0.203 5，0.247 1 mg，人參皂苷Re 0.125 4，0.133 5，0.128 5 mg，人參皂苷Rb10.220 0，0.215 8，0.228 5 mg。

3 討論

UPLC是在高效液相色譜法基礎(chǔ)上采用小顆粒填料，結(jié)合超高壓輸液泵及高靈敏度檢測器發(fā)展而來的一種新興色譜技術(shù)，其效率高、流動相試劑消耗少，節(jié)約、環(huán)保，分離度高，適合同時分析多成分，靈敏度高、進樣量少，適合低組分含量分析。參杞通脈膠囊成分復(fù)雜、人參皂苷含量低，適合采用UPLC法。

曾采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱進行試驗，未能將3種人參皂苷分離。而HSS T3色譜柱填料為高強度硅膠顆粒，T3對極性分子具有較強的反相保留能力，對極性類的皂苷成分有較好的分離效果。

由于UPLC柱容量小，需對樣品進行凈化處理，因此先用高倍三氯甲烷、乙醚混合液除去脂溶性成分，然后用甲醇提取、蒸干后水溶解、正丁醇萃取，氨試液、水飽和的正丁醇洗滌除去雜質(zhì)，滿足色譜分離要求，陰性對照無干擾。本研究中建立的方法重復(fù)性好，精密度高，穩(wěn)定性好，回收率符合要求，可用于該制劑的質(zhì)量控制。