不同豆類蛋白組成、結(jié)構(gòu)和功能特性

惠君玉，熊江紅，楊安樹，陳紅兵

(1.南昌大學(xué)a.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；b.資源環(huán)境與化工學(xué)院； c.中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；2.江西省精神病院，江西 南昌 330029)

豆科植物的年產(chǎn)量僅次于小麥、水稻、玉米和大麥，居世界第五位。我國豆類資源十分豐富，品種繁多，歷史悠久，在全國各地都有種植與生產(chǎn)。豆類種子中含有豐富的蛋白質(zhì)、油脂和碳水化合物以及維生素和礦物質(zhì)等。豆科植物是現(xiàn)代保健功能食品開發(fā)的重要資源，尤其在那些因宗教、文化習(xí)慣等影響動物蛋白質(zhì)消費受到限制的國家中[1],豆類是廉價、優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)的主要來源之一。

豆類蛋白不僅具有很高的營養(yǎng)價值，同時還具有多種功能特性(如持水性、持油性、起泡性、乳化性等)，且這些功能特性與豆類蛋白的氨基酸組成、亞基組成和結(jié)構(gòu)等有密切關(guān)系；同時，不同功能特性之間相互作用，進(jìn)而影響豆類蛋白在食品加工方面的應(yīng)用。因此，為了豆類蛋白的高效利用和消費者的認(rèn)可，深入研究豆類蛋白質(zhì)的功能特性顯得十分重要。

豆類蛋白具有許多有益人體健康的生理功能，如控制高膽固醇、2型糖尿病以及預(yù)防各種癌癥和心血管疾病等[2]。近年來，不同品種豆類的研究引起了人們的日益重視。目前，國內(nèi)外有關(guān)不同豆類的研究主要集中于品種的選育、功能因子生物活性探索和蛋白提取工藝優(yōu)化等方面，如Dubey等[3]培育和開發(fā)抗旱大豆；Jayamanohar[4]等利用水提取紅蕓豆中多糖，并研究其益生元潛力；張英蕾等[5]報道了堿溶酸沉法從黑豆中提取蛋白的工藝優(yōu)化。但在常見豆類蛋白的組成、結(jié)構(gòu)差異及其對蛋白功能特性的影響等方面研究相對缺乏。蛋白質(zhì)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)決定了其獨特的功能特性。因此，本文選取10種常見的豆類為研究對象，探討不同豆類中蛋白的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)和功能特性的差異，以期為豆類蛋白質(zhì)資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 試劑與材料

1.1 材料與試劑

豆類購于南昌大學(xué)天虹超市，大豆油購于旺中旺超市。

1.2 儀器設(shè)備

S433D氨基酸分析儀(北京捷盛依科科技發(fā)展有限公司)；高速分散機(德國IKA公司)；高效液相色譜儀(日本島津公司)；紫外可見分光光度計(美國PE公司)；Mini垂直蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；F-4500熒光分光光度計(日本日立公司)；SQ-GS800光密度掃描儀(北京宇艾電子科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆類蛋白的提取

利用堿提酸沉法提取蛋白：將新鮮的豆類種子碾碎成粉末后，與石油醚混合，室溫下攪拌2 h進(jìn)行脫脂，重復(fù)3次，將脫脂豆粉與蒸餾水按照1:10(g·mL-1)比例混合后，用NaOH(1 mol·L-1)溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，室溫下攪拌2 h后，離心(8 000 r·min-1)20 min取上清液，用 HCl(1 mol·L-1)溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5；靜置0.5 h后，于4500 r·min-1、4 ℃下離心20 min得到蛋白沉淀；最后將蛋白沉淀溶于去離子水，用NaOH(1 mol·L-1)溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，用透析袋透析24 h，6 h換1次水，冷凍干燥后于-20 ℃保存。

1.3.2 豆類蛋白的組成

1.3.2.1 氨基酸的測定

分別稱取一定量的豆類蛋白粉置于水解管中，加入10 mL鹽酸(6 mol·L-1)和1 mL苯酚，充氮氣后在110 ℃下水解24 h，冷卻后，分別將水解液進(jìn)行過濾、定容。吸取樣品1 mL于培養(yǎng)皿中，用真空干燥器在50 ℃干燥，加3 mL超純水蒸干除去鹽酸，重復(fù) 1次，加入3 mL上樣緩沖液(pH 2.2)后，將待測樣品用微孔濾膜(0.22 μm)過濾后，再利用氨基酸自動分析儀進(jìn)行氨基酸含量分析[6]。

1.3.2.2 SDS-PAGE

利用SDS-PAGE分析不同品種豆類蛋白的分子量分布情況，操作詳細(xì)步驟依據(jù)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.3.3 豆類蛋白結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 紫外光譜分析

采用紫外可見分光光度計分析蛋白的空間折疊情況。設(shè)定紫外吸收光譜的波長掃描范圍為200～500 nm，光徑為1 cm，波長間隔1.0 nm，掃描速度為240 nm·min-1，樣品濃度為0.2 mg·mL-1，室溫下測定其吸光值，PBS溶液為空白對照。

1.3.3.2 表面疏水性分析[8]

用PBS溶液(0.01 mol·L-1，pH 7.0)將豆類蛋白稀釋成0.2 mg·mL-1，取5 mL樣品分別加入50 μLANS (8 μM) 溶液，在渦旋儀上攪拌混勻，室溫避光反應(yīng)1 h后，測其熒光強度。熒光光譜測定條件為：激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長400～650 nm，光徑1 cm，掃描速度1 200 nm·min-1，狹縫寬度5.0 nm，響應(yīng)時間2.0 s。

1.3.3.3 表面巰基的測定

將豆類蛋白用Tris-甘氨酸緩沖溶液(0.1 mol·L-1，pH 8.0)稀釋至1.0 mg·mL-1，分別取5 mL樣品稀釋液加入40 μL Ellman溶液，在25 ℃下避光放置10 min，后在 412 nm處測上清液的吸光度?？瞻讓φ沼肨ris-甘氨酸稀釋液。

1.3.4 蛋白質(zhì)功能特性

1.3.4.1 持水性[9-10]

在已稱重的離心管(m1)中分別加入一定量豆類蛋白粉(m)，然后分散、搖勻，使各蛋白可以充分吸水，室溫(25 ℃)放置30 min，間隔10 min震蕩1次，于離心機中4 000 r·min-1下離心25 min，去上清液，再將樣品與離心管一同置于50 ℃下干燥25 min，使其管壁的殘余水分揮發(fā)，后稱質(zhì)量為m2。

(1)

式中：m—樣品質(zhì)量g；m1—離心管質(zhì)量g；m2—離心管和沉淀物質(zhì)量g。

1.3.4.2 持油性[9-10]

稱取0.20 g豆類蛋白(m)，加入已稱重的離心管(m3)中，隨后加入大豆油3 mL，攪拌1 min使其充分接觸油脂，室溫放置30 min，4 000 r·min-1下離心25 min，用移液槍吸去上層油脂，再將離心管倒置25 min，除去流出的油脂，后稱質(zhì)量m4。

(2)

式中：m—樣品質(zhì)量g；m3—離心管質(zhì)量g；m4—離心管和沉淀物質(zhì)量g。

1.3.4.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

用PBS溶液(0.01 mol·L-1，pH 7.0)將豆類蛋白樣品配制為1 %的蛋白溶液，取30 mL樣品于量筒中，用高速分散器以10 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速分散2 min。記錄均質(zhì)停止時泡沫體積數(shù)V1和停止后30 min的V2，起泡性與泡沫穩(wěn)定性[11]按下式計算：

(3)

(4)

1.3.4.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性

用PBS溶液(0.01 mol·L-1，pH 7.0)將豆類蛋白樣品配制為1%的蛋白溶液，加入大豆油(體積比3:1)，混合均勻后，于高速分散器(10 000 r·min-1)中分散2 min，從底部抽取樣品液50 μL，用配制好的SDS溶液(0.1 %)稀釋(體積比1:100)，記錄其在500 nm下的吸光值A(chǔ)0。靜置10 min后，從底部抽取樣品液50 μL，再次按同體積比稀釋后記錄吸光值A(chǔ)10。乳化性與乳化穩(wěn)定性[12]按下列公式計算：

(5)

(6)

式中：c-白質(zhì)濃度g·mL-1

1.3.5 統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)處理采用Excel 2013與SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，并用 Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆類蛋白中氨基酸分析

氨基酸組成和含量是評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值重要指標(biāo)，豆類蛋白的氨基酸組成接近人體需要，對豆類蛋白的營養(yǎng)進(jìn)行分析尤為重要。由表1看出，在這10種豆類蛋白氨基酸組分中，均為Glu含量最高，Met含量最低，因此Met是豆類蛋白的第一限制氨基酸。Glu與Met中含量最高的豆類蛋白是豇豆蛋白。豆類蛋白中必需氨基酸含量豐富，含量較高的必需氨基酸是Leu與Lys，其中鷹嘴豆蛋白中必需氨基酸占總氨基酸含量百分比(EAA/TAA)最高為36.17%，豌豆蛋白EAA/TAA最低，為30.37%，其余豆類蛋白中EAA/TAA由高到低依次為：刀豆蛋白、豇豆蛋白、紅豆蛋白、綠豆蛋白、蕓豆蛋白、扁豆蛋白、大豆蛋白和黑豆蛋白。

表1 豆類蛋白中氨基酸組成(g/100 g蛋白)

2.2 SDS-PAGE分析

從圖1中可以看出：不同品種的豆類蛋白組成之間有明顯差異，豌豆蛋白(豌豆屬，泳道1)的電泳條帶顏色較淺，主要蛋白的分子量約75 kDa；蕓豆蛋白(菜豆屬，泳道2)的分子量主要介于32～55 kDa之間；而刀豆蛋白(菜豆屬，泳道3)的分子量在17～130 kDa之間；扁豆蛋白(扁豆屬，泳道4)在17～130 kDa之間均有少量分布；鷹嘴豆蛋白(鷹嘴豆屬，泳道8)的分子量主要在17～95 kDa之間，有較多的亞基條帶；綠豆蛋白、紅豆蛋白、豇豆蛋白(泳道5—7)都屬于豇豆屬，其主要蛋白分子量在55～72 kDa之間。泳道9、10分別為黑豆蛋白與大豆蛋白，電泳圖表明這兩種豆類蛋白的組成相似，其主要成分為β-伴大豆球蛋白(7S)與大豆球蛋白(11S)，與文獻(xiàn)[13]報道一致。其中，β-伴大豆球蛋白(7S)是由α′(約71 kDa)、α (約67 kDa)和 β (約50 kDa) 3種亞基[14]經(jīng)疏水作用組成；而大豆球蛋白(11S)是由一個酸性多肽鏈A(約38 kDa)和一個堿性多肽鏈B(約20kDa)通過二硫鍵連接形成[15-16]。通過電泳結(jié)果表明：來源不同屬的豆類蛋白，其所含的亞基和分子量有所不同。

M：Marker，1:豌豆，2:蕓豆，3:刀豆，4:扁豆，5:綠豆，6:紅豆，7:豇豆，8:鷹嘴豆，9:黑豆，10:大豆。

圖1豆類蛋白的電泳圖

2.3 豆類蛋白的結(jié)構(gòu)

2.3.1 紫外光譜分析

紫外光譜的吸光度反映了蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)以及組氨酸和半胱氨酸的殘基側(cè)鏈基團對紫外光的吸收[17]。由紫外光譜圖可以看出：各個豆類蛋白在波長280 nm處有最大吸收峰，不同豆類蛋白中，刀豆蛋白的紫外吸收最強，其次是紅豆蛋白與綠豆蛋白，而鷹嘴豆蛋白的紫外吸光最弱，這可能是由于刀豆蛋白表面的色氨酸和酪氨酸含量較高，而其他豆類蛋白表面紫外生色基團的含量較低[18]。

2.3.2 表面疏水性分析

疏水作用是指氨基酸殘基在水溶液中為了避開水相而相互聚集的一種非共價的相互作用，是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的重要作用力，且對蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)具有重要的影響[19]。一般而言，蛋白熒光強度越大，其表面疏水性越強。由圖3可知：在10種豆類蛋白中，豌豆的熒光強度最高，刀豆蛋白的熒光強度最低，并且豌豆蛋白與刀豆蛋白相比，熒光光譜最大發(fā)射峰出現(xiàn)了一定的藍(lán)移，表明豌豆蛋白的表面疏水性最強，刀豆蛋白表面疏水性最弱，其他豆類蛋白表面疏水性由強到弱依次為大豆蛋白、紅豆蛋白、綠豆蛋白、豇豆蛋白、鷹嘴豆蛋白、黑豆蛋白、扁豆蛋白和蕓豆蛋白。

2.3.3 表面巰基分析

豆類蛋白中含有較豐富的巰基與二硫鍵，球蛋白中大豆球蛋白(11S)的巰基含量高于β-伴大豆球蛋白(7S)，11 S蛋白分子中含有44個半胱氨酸殘基(-Cys)[20]，而7S蛋白中僅含有4個半胱氨酸殘基(-Cys)，可以通過測定蛋白表面游離巰基的含量來分析蛋白的結(jié)構(gòu)。從圖4中可以明顯看出：豆類蛋白的巰基含量范圍在 1.11～6.79 μmol·g-1之間，其中鷹嘴豆蛋白的表面巰基含量最高，為6.79 μmol·g-1，顯著高于其他豆類蛋白的表面巰基含量，刀豆蛋白面巰基含量最低，為1.11 μmol·g-1。巰基與二硫鍵都對維系蛋白空間結(jié)構(gòu)有著重要的作用，在體內(nèi)和加工條件下，二者之間可實現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

2.4 豆類蛋白的功能特性

2.4.1 持水性與持油性

持水性對食品的質(zhì)構(gòu)有很大影響，溶解度較高的蛋白質(zhì)具有較好的分散性，可以形成良好的分散體系，因此提高了蛋白質(zhì)的持水性[21]，而持油性與蛋白質(zhì)分子表面親油基團有關(guān)，對于改善產(chǎn)品口感、保持風(fēng)味很重要[22]，所以持油性也是衡量蛋白功能特性的重要指標(biāo)之一。由圖5A可知：豆類蛋白的持水性存在顯著差異(P<0.05)，刀豆蛋白的持水性最高為4.75 g·g-1；豌豆蛋白的持水性最低為2.42 g·g-1，這與上述豆類蛋白的疏水性研究結(jié)果相符合，也由此印證了蛋白疏水作用對其功能性質(zhì)的影響。由圖5B可以看出：黑豆蛋白的持油性最高是6.69 g·g-1，明顯高于其他豆類蛋白，而刀豆蛋白與大豆蛋白的持油性相近，豇豆蛋白的持油性最低3.56 g·g-1。蛋白質(zhì)持水性與持油性對食品的加工應(yīng)用有重要意義，良好的持水性與持油性有助于食品在儲藏期間的“保鮮”及“成型”。

2.4.2 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

起泡性和泡沫穩(wěn)定性可以賦予加工食品保持疏松的結(jié)構(gòu)和良好的口感，蛋白的起泡性是指蛋白質(zhì)可以起泡的能力，而泡沫穩(wěn)定性是指泡沫保持穩(wěn)定的能力[23]。由圖6可以看出，大豆蛋白起泡性最高(61.67%)，其泡沫穩(wěn)定性也很高(75.96%)；其次是刀豆蛋白，具有良好的起泡性及泡沫穩(wěn)定性；鷹嘴豆蛋白、豇豆蛋白、紅豆蛋白和蕓豆蛋白的起泡性較高，但是泡沫穩(wěn)定性均偏低；綠豆蛋白、扁豆蛋白與豌豆蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性都較低；而黑豆蛋白的起泡性最低(9.67%)，但其泡沫穩(wěn)定性最高(88.69%)，這可能與豆類蛋白的結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)復(fù)合物在水與空氣界面的相互作用相關(guān)[24]。有研究表明，泡沫主要是由溶解的蛋白質(zhì)參與形成的，蛋白質(zhì)的濃度越高，泡沫的黏度越大，可以在水與空氣界面上形成多層的黏附性蛋白質(zhì)膜；而溶解度低的蛋白質(zhì)形成的泡沫較少，其對蛋白質(zhì)的起泡力貢獻(xiàn)很少,但這些不溶解的蛋白質(zhì)分子由于靜電吸附增加了蛋白質(zhì)膜的黏合力,提高了蛋白的泡沫穩(wěn)定性[25]。

2.4.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性

乳化性是指蛋白質(zhì)在水油混合物中的形成乳液的能力[26]，表面疏水性、溶液pH值、離子強度、溫度和油相體積等因素在一定程度上影響了蛋白的乳化性能，而乳化穩(wěn)定性是指乳液對外界壓力保持穩(wěn)定的能力。由圖7可以看出，黑豆蛋白的乳化性最高，其后依次是紅豆蛋白、蕓豆蛋白、豇豆蛋白，綠豆蛋白與刀豆蛋白的乳化性相近，而鷹嘴豆蛋白的乳化性最低。在乳化性穩(wěn)定性方面，鷹嘴豆蛋白與刀豆蛋白的乳化性穩(wěn)定性相對較高，而豇豆蛋白乳化性穩(wěn)定性最低。綜合考慮蕓豆蛋白具有較好的乳化性及乳化穩(wěn)定性。黑豆蛋白的乳化性最高，其持油性也最高，表明蛋白乳化性與其親油基團有關(guān)聯(lián)性。

3 結(jié)論

本文分析探討了常見10種豆類中蛋白質(zhì)的氨基酸組成、分子量范圍、結(jié)構(gòu)和功能特性。結(jié)果表明：在10種豆類蛋白的氨基酸組成中，均為Glu含量最高，Met含量最低，不同豆類蛋白中必需氨基酸含量占總氨基酸含量比最高是鷹嘴豆蛋白，最低是豌豆蛋白。不同豆類蛋白的亞基組成和分子量存在一定差異，蕓豆蛋白的分子量主要在32～55 kDa之間；綠豆、紅豆、豇豆等豇豆屬豆類蛋白主要分子量在55～72 kDa之間；其他豆類蛋白的分子量分布范圍較大，其中，黑豆蛋白與大豆蛋白的組成相似，主要成分為β-伴大豆球蛋白(7S)與大豆球蛋白(11S)。不同豆類蛋白的結(jié)構(gòu)有所不同，刀豆蛋白紫外吸收最強，鷹嘴豆蛋白的紫外吸收最弱；豌豆蛋白的表面疏水性最強，刀豆蛋白表面疏水性最弱；鷹嘴豆蛋白的表面巰基含量最高，刀豆蛋白的表面巰基含量最低。蛋白質(zhì)的加工特性方面，刀豆蛋白持水性最高，豌豆蛋白持水性最低；黑豆蛋白持油性最高，豇豆蛋白持油性最低；大豆蛋白和刀豆蛋白具有較好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，黑豆蛋白泡沫穩(wěn)定性最好，但起泡性較差；黑豆蛋白乳化性最好，但乳化穩(wěn)定性較差，鷹嘴豆蛋白乳化性較差，而乳化穩(wěn)定性最好，而蕓豆蛋白具有較好的乳化性和乳化穩(wěn)定性。因此，在以豆類蛋白為基料的食品加工中，可根據(jù)特定生產(chǎn)需要擇優(yōu)選取豆類品種；同時，針對某些豆類蛋白，通過適當(dāng)?shù)募庸じ男钥赏卣蛊涔δ芴匦缘膽?yīng)用范圍。