超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中三苯甲烷類染料和氯霉素類藥物的殘留量

萬承波，萬建春，羅秋紅，占春瑞*

(1.江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測院，江西 南昌 330052；2.南昌海關(guān)技術(shù)中心，江西 南昌 330038)

三苯甲烷染料是一類工業(yè)染料，因其有較好的殺菌作用，它早期作為驅(qū)蟲劑、殺蟲劑、防腐劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用，用于預(yù)防與治療各類水生動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病。氯霉素類藥物是類廣譜抗生素，能夠預(yù)防和治療動物各種細菌性疾病，早期被用于畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖[1]。三苯甲烷染料和氯霉素類藥物具有殘留時間長，三苯甲烷染料存在致癌、致畸、致突變等副作用[2]，氯霉素類藥物也具有嚴重的毒副作用，它可以抑制骨髓造血機能，引起再生障礙性貧血和其他惡性血液病[3]，因此世界上許多國家都禁止這兩類物質(zhì)在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的使用，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部250號公告也將氯霉素和孔雀石綠列入《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》中。

目前水產(chǎn)品中孔雀石綠(Malachite green,MG)、結(jié)晶紫(crystalviolet,CV)、及其代謝物隱性孔雀石綠(1eucom alchite green,LMG)、隱性結(jié)晶紫(1eucocrysta lviolet,LCV)、氯霉素(Chloramphenicol，CAP)、甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)、氟甲砜霉素(Florfenicol，F(xiàn)F)殘留量的檢測方法的研制受到廣泛關(guān)注，主要有免疫吸附法[4-5]、熒光光譜法[6]、高效液相色譜法[7-8]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10-15]、液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法[16]，前處理采用乙腈或乙酸鹽緩沖液提取，固相萃取凈化富集等技術(shù)。氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法需經(jīng)過衍生硅烷化，過程較復(fù)雜，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法前處理相對簡單，檢測靈敏度高。雖然目前水產(chǎn)品中三苯甲烷染料和氯霉素類藥物殘留量的檢測手段呈現(xiàn)多樣化，但兩類物質(zhì)同時檢測的方法未見報道，本文建立了水產(chǎn)品中三苯甲烷染料和氯霉素同時檢測的方法，該方法在測定低限滿足現(xiàn)行法規(guī)標準的要求的同時，提高了檢測效率和降低了檢測成本。

1 實驗部分

1.1 儀器和材料

API 4000+型四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB SCEIX公司，配島津LC-30A超高效液相色譜儀，日本SHIMADZU公司；IKA T25高速均質(zhì)機，德國IKA公司；常速離心機，上海安亭公司；KQ-600B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；N-EVAPTM112型氮吹濃縮儀，美國Organomatian Associates公司；SIG 560E型號旋渦混合器，美國Scientific Industries公司；Option-Q15型超純水一體機，英國ELGA公司；固相萃取裝置(美國Supelco公司)。

孔雀石綠草酸鹽(Malachite green oxalate salt，CAS 2437-29-8)，隱性孔雀石綠(leucomalachite green，CAS 129-73-7)，結(jié)晶紫(Basic Violet 3，CAS 548-62-9)，隱性結(jié)晶紫(Leucoc rystal Violet，CAS 603-48-5)，氯霉素(Chloramphenicol，CAS 56-75-7)，甲砜霉素(Thiamphenicol，CAS 15318-45-3)氟甲砜霉素(Florfenicol，CAS 76639-94-6)，氘代氯霉素(Chloramphenicol-D5，CAS 202480-68-0)等標準品均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司?？兹甘G同位素-D5，隱性孔雀石綠同位素-D6，購自上海安譜公司。甲醇(色譜純，德國Merck公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；乙酸銨(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙酸(色譜純，美國TEDIA公司)；中性氧化鋁固相萃取小柱(美國Supelco公司)；水為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm-1)。

1.2 儀器條件

1.2.1 三苯甲烷染料儀器條件

HPLC條件：色譜柱：Waters UPLC BEH RP C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流動相A：40 mmol·L-1乙酸銨(含2%乙酸)溶液；流動相B：乙腈；梯度洗脫：0～0.5 min，50% B，0.5～1.0 min，50%～95% B，1.0～3.0 min，90% B，3.0～3.5 min，90%～50% B，3.5～5.0 min，50% B，流速：0.2 mL·min-1，進樣體積：5L，柱溫：40 ℃。

MS條件：ESI正模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，霧化氣壓力(GS1)：20 psi，輔助氣壓力(GS2)：60 psi，氣簾氣壓力(CUR)：40 psi，離子源溫度：600 ℃，電噴霧電壓(IS)：5 000 V，各化合物去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)見表1。

表1 三苯甲烷染料化合物質(zhì)譜參數(shù)

1.2.2 氯霉素類藥物儀器條件

HPLC條件：色譜柱：Waters UPLC BEH RP C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流動相A：水，流動相B：乙腈；梯度洗脫：0～1.0 min，30% B，1.0～2.0 min，30%～60% B，2.0～4.0 min，60%～90% B，4.0～4.1 min，90%～30% B，4.1～6.0 min，30% B，流速：0.2 mL·min-1，進樣體積：5L，柱溫：40 ℃。

MS條件：ESI負離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，霧化氣壓力(GS1)：50 psi，輔助氣壓力(GS2)：50 psi，氣簾氣壓力(CUR)：10 psi，離子源溫度(TEM)：500 ℃，電噴霧電壓(IS)：-4 500 V，各化合物去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)見表2。

表2 氯霉素類藥物質(zhì)譜參數(shù)

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取適量三苯甲烷染料標準品和內(nèi)標物，用乙腈溶解配成1.0 mg·mL-1的標準儲備液，用棕色玻璃瓶盛放，于-18 ℃下保存。準確稱取適量氯霉素類標準品和內(nèi)標物，用甲醇溶解配成100 μg·mL-1的標準儲備液，用棕色玻璃瓶盛放，于-18 ℃下保存。分別移取適量的氯霉素類藥物和三苯甲烷染料標準儲備液，用乙腈逐級稀釋成10、50、100 ng·mL-1的標準中間液。分別移取內(nèi)標物儲備液用，乙腈逐級稀釋成100 ng·mL-1內(nèi)標物中間液。

1.3.2 定容液和流動相的配制

40 mmol·L-1乙酸銨溶液：準確稱取3.15 g乙酸銨，用純水溶解并定容至1 000 mL；乙腈-40 mmol·L-1乙酸銨溶液(1+1，v:v)：準確量取50 mL乙腈，加入50 mL 40 mmol·L-1乙酸銨溶液，混合均勻；40 mmol·L-1乙酸銨(含2%乙酸)溶液：向998 mL 40 mmol·L-1乙酸銨溶液中加入2 mL乙酸，混合均勻。

1.3.3 樣品前處理

稱取試樣5.0 g，置于50 mL聚丙烯離心管內(nèi)，加入11 mL乙腈，高速均漿提取30 s，在4 500 r·min-1下離心5 min，上層清液轉(zhuǎn)入25 mL比色管中，殘渣中再加入11 mL乙腈，渦旋混合30 s，超聲提取5 min，在4 500 r·min-1下離心5 min，合并上層清至25 mL比色管中，用乙腈定容，混合均勻后待凈化。取5 mL提取液倒入經(jīng)5 mL乙腈活化平衡的中性氧化鋁小柱內(nèi)，再用5 mL乙腈洗脫，收集全部流出液，洗脫液在45 ℃以下水浴，氮吹至干，殘渣用2 mL定容液定容，超聲溶解后過0.22 μm濾膜，供UHPLC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

蠕動泵將標準溶液泵入質(zhì)譜儀，三苯甲烷染料在ESI正模式下有最佳的響應(yīng)值，質(zhì)譜全掃描獲得MG和CV及其代謝物的分子峰[M+H]+，加上碰撞電壓時，MG、CV及其代謝物，都會產(chǎn)生失去一個甲基和一個二甲基苯胺碎片離子。氯霉素類藥物在負模式下掃描響應(yīng)值較高，質(zhì)譜全掃獲得其分子峰[M-H]-，加上碰撞電壓時，其結(jié)構(gòu)中2-二氯乙酰胺基都易失去或發(fā)生結(jié)構(gòu)重組。歐盟2002/675 EC指令規(guī)定，質(zhì)譜確證方法需要4個確證點數(shù)，每個待物選擇兩對離子，作為定性離子，同位素內(nèi)標物選擇一對定量參比離子。確定掃描離子對后，聯(lián)接液相進樣，對質(zhì)譜離子源參數(shù)進行優(yōu)化，自動優(yōu)化獲得最佳電噴霧電壓(IS)、霧化氣壓力(GS1)、輔助氣壓力(GS2)、氣簾氣壓力(CUR)、離子源溫度(TEM)。

2.2 色譜條件的選擇

三苯甲烷染料和氯霉素類藥物為中等極性到弱極性化合物，在反相色譜中均可保留，目前多數(shù)文獻和標準方法均采用反相色譜進行分離[15-17]。三苯甲烷類藥物正模式掃描，在流動相中加入一定揮發(fā)性酸能促進化合物的電離，可以提高靈敏度，而氯霉素類藥物在負模式掃描，加入酸會抑制化合物的電離，導(dǎo)致響應(yīng)值下降，兩類化合物在同一色譜條件下進行分析，靈敏度比較難兼顧，因此本方法確定兩類采用不同儀器條件進行分析檢測。

實驗比較了不同的色譜柱，發(fā)現(xiàn)Waters UPLC BEH RP C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)相比Waters UPLC HSS T3柱(50 mm×1.0 mm，1.8 μm)分離效果較好，化合物響應(yīng)值更高，因此確定Waters UPLC BEH RP C18柱為本方法分析用色譜柱。

2.3 提取和凈化條件的選擇和優(yōu)化

多數(shù)文獻報道采用乙酸乙酯、乙腈等有機溶液提取水產(chǎn)品中氯霉素類藥物，三苯甲烷染料及其代謝物[8，18-19]，本方法比較了乙腈和乙酸乙酯不同的提取效率，實驗發(fā)現(xiàn)乙腈提取整體效率要做優(yōu)于乙酸乙酯，尤其是LMG，乙酸乙酯提取回收率都在20%以下，而乙腈的提取回收率均在85%以上，TAP和MG用乙酸乙酯提取的回收率在50%以下，乙腈的提取回收率除鰻魚的回收率略低于70%，在小龍蝦和鯉魚提取回收率都超過了80%，可能是因為鰻魚中含油脂較多的原因，由于部分藥物的極性相對較強，乙酸乙酯提取效率不高，乙酸乙酯提取的油脂較多，基質(zhì)效應(yīng)可能也影響了提取回收率，因此本方法確定乙腈作為提取溶劑。

水產(chǎn)品中三苯甲烷染料和氯霉素類藥物殘留量較低，樣品在提取后需進行進一步純化富集。液液萃取操作繁瑣且有機溶劑消耗量大，冷凍除油凈化[19]，固相萃取凈化HLB柱[20-21]等凈化方式均有相關(guān)報道，但兩類藥物同時純化的處理方式未見報道。三苯甲烷染料和氯霉素類藥物的極性跨度大，且三苯甲烷染料在水溶液中為陽離子，采用反相或離子交換作用機理的固相萃取方式，可能難以兼顧兩類藥物，本方法采用正相純化的方式，以除去提取液共萃取油脂等非極性雜質(zhì)。中性氧化鋁柱是一種正相保留機理的固相萃取柱，能夠吸附極性化合物，并去除油脂。本方法采用中性氧化鋁柱凈化，能夠去除共萃取物中的油脂，同時對目標物不會產(chǎn)生死吸附，對比了不同品牌的中性氧化鋁小柱，除品牌C的穩(wěn)定性略差外，品牌間純化效果的差異并不明顯。同時考查了洗脫體積對回收率的影響，5 mL乙腈洗脫基本能將目標物全部洗脫下來，再增加5 mL乙腈洗脫未檢出目標物，且濃縮后殘渣有一些增加，考慮后續(xù)濃縮時雜質(zhì)干擾的影響，洗脫體積確定為5 mL。

2.4 特異性

本方法用空白鰻魚、小龍蝦、鯉魚樣品與其對照加標樣品，進行全過程實驗，實驗結(jié)果表明兩類藥物均具有良好的特異性，在目標物出峰處無干擾峰。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是影響質(zhì)譜法定量結(jié)果重要因素，本方法考查了基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響，用空白基質(zhì)溶液配制標準曲線與試劑配制標準曲線比較，通過計算基質(zhì)標準曲線與試劑過原點標準曲線斜率比值的關(guān)系，確定基質(zhì)效應(yīng)。實驗結(jié)果表明鰻魚、小龍蝦和鯉魚基質(zhì)中各化合物存在不同的基質(zhì)效應(yīng)作用，而且基質(zhì)作用的強弱有所差異，三苯甲烷染料基質(zhì)效應(yīng)非常大，氯霉素類藥物也存在一定的基質(zhì)效應(yīng)。在定量時采用同位素內(nèi)標可以消除基質(zhì)效應(yīng)，但本方法所測定的7種化合物只有3種化合物有同位素內(nèi)標，為有效消除基質(zhì)效應(yīng)，本方法確定采用基質(zhì)標準曲線定量，孔雀石綠、隱性孔雀石綠、氯霉素采用同位素內(nèi)標定量，其它4種化合物采用基質(zhì)外標法定量。

2.6 測定低限和線性范圍

用空白鰻魚、小龍蝦、鯉魚加標實驗，通過計算目標物的信噪比，以信噪比大于10的濃度確定定量限，三苯甲烷染料定量限為0.5 μg·kg-1，氯霉素定量限為0.1 μg·kg-1，甲砜霉素和氟甲砜霉素定量限為1.0 μg·kg-1?？疾榱嘶|(zhì)標準曲線的線性范圍，三苯甲烷染料在0.25～5.0 μg·kg-1，氯霉素在0.05～2.0 μg·kg-1，甲砜霉素和氟甲砜霉素在0.5～20.0 μg·kg-1濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。

2.7 準確度和精密度

用空白鰻魚、小龍蝦、鯉魚樣品加標方式進行準確度和精密度實驗，實驗分別在1、2和4倍定量限濃度水平進行實驗，加標回收率在61.5～119.0%之間，RSD值在0.76～14.46%之間。

表3 7種藥物在鯉魚基質(zhì)中的定量限、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、回收率及相對標準偏差(n=6)

表4 7種藥物在鯉魚基質(zhì)中的定量限、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、回收率及相對標準偏差(n=6)

表5 7種藥物在鯉魚基質(zhì)中的定量限、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、回收率及相對標準偏差(n=6)

3 實際樣品檢測

本方法建立的水產(chǎn)品中三苯甲烷染料和氯霉素類藥物殘留量同時檢測的方法，操作簡單、特異性強、靈敏度高。實際檢測100多批次樣品，其中檢出1批次鰻魚氟甲砜霉素殘留陽性，實際運用證明本方法準確可靠，該方法可適用于鰻魚、小龍蝦、鯉魚等產(chǎn)品的三苯甲烷染料和氯霉素類藥物殘量的同時測定。