基于Biolog-Eco法對鄱陽湖不同濕地類型下土壤微生物功能多樣性

吳 蘭，程家勁，賀 勇，陳圓圓，劉 穎，魏 鑫，劉亞軍，

(南昌大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點實驗室，江西 南昌 330031)

濕地是介于水陸生態(tài)系統(tǒng)之間的過渡帶，因其獨特的水文特征，使其成為全球碳密度最高的區(qū)域[1]。水文通過影響濕地水淹深度、持續(xù)時間、干濕交替頻次，控制著濕地生物地球化學(xué)循環(huán)過程[2]。受水情長期驅(qū)動的影響，湖泊濕地形成了復(fù)雜多樣的濕地景觀類型[3]。近年來，由于極端天氣(干旱、洪水等)的頻繁發(fā)生，加速了內(nèi)陸湖泊濕地的退化，主要表現(xiàn)為濕地水位下降、景觀格局變化劇烈等生態(tài)問題[4-5]。濕地景觀類型的變化對濕地生態(tài)系統(tǒng)的能量流動、物質(zhì)循環(huán)以及物種遷移等都會產(chǎn)生很大影響[6]。目前圍繞不同濕地類型的研究大多集中在濕地植物、野生動物和土壤性質(zhì)上[7-8]。土壤微生物作為濕地生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，參與了濕地土壤中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動，深入研究濕地土壤微生物群落功能多樣性，對評價濕地土壤質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)功能具有重要意義[9]。而當(dāng)前有關(guān)不同濕地類型下土壤微生物功能活性的研究卻鮮見報道。

當(dāng)前，對于濕地土壤微生物的研究大多集中在物種組成和群落結(jié)構(gòu)上，較少直接關(guān)注微生物的功能活性，更多的是通過基因序列對微生物群落的功能代謝進行推測[10-11]。而考慮到微生物群落表現(xiàn)出的功能可塑性和功能冗余現(xiàn)象，使得微生物群落結(jié)構(gòu)和組成變化很難直接反映在功能上[12]。因此研究不同濕地類型下土壤微生物的代謝特征，是揭示景觀格局劇烈變化下濕地生態(tài)功能轉(zhuǎn)變的重要基礎(chǔ)。Biolog-Eco微平板法是目前研究微生物代謝多樣性的一種有效方法，通過分析微生物對31種碳源的利用程度來反映其功能多樣性，能夠表征微生物群落的整體活動，而不需要分析單個微生物，這種簡單的高分辨率檢測方法已廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)和環(huán)境微生物檢測中[13]。

鄱陽湖作為一個典型的季節(jié)性通江淺水湖，濕地類型多樣、景觀變化劇烈[14]?；诖?，在鄱陽湖全湖范圍內(nèi)選擇長期水情驅(qū)動形成的4種濕地類型為研究對象，采集表層土壤，分析土壤理化性質(zhì)，同時采用Biolog-Eco微平板法對微生物碳代謝活性特征進行分析，以揭示不同濕地景觀下土壤的生態(tài)功能特征變化，以期為濕地生態(tài)保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況及樣地介紹

鄱陽湖是我國第一大淡水湖泊，地處江西省北部、長江中下游南岸，承接五河之水，匯通長江，是典型的洪泛湖泊。所在區(qū)域?qū)賮啛釒駶櫦撅L(fēng)型氣候，年均氣溫17.6 ℃，年降雨量1 450～1 550 mm。鄱陽湖水位呈明顯的周期性變化(平均年內(nèi)水位變幅為11.01 m)，每年10月進入枯水期，隨著水位的漲落，鄱陽湖濕地呈現(xiàn)出草洲濕地、河流濕地、泥灘濕地、湖泊濕地等多種濕地類型，形成了以湖泊濕地為核心的多類型復(fù)合的濕地生態(tài)系統(tǒng)類型[15]。本實驗選取草洲、泥灘、河口、湖泊作為典型的研究樣地，其土壤質(zhì)地及淹水狀況見表1。

表1 不同濕地類型土壤質(zhì)地及淹水情況

1.2 樣品采集

本研究于鄱陽湖枯水期進行樣品采集(具體采樣時間及樣地坐標(biāo)信息如表2所示)，此時湖泊濕地土壤表現(xiàn)出不同的覆蓋類型。選擇草洲(為更具有代表性選擇處于不同高程上的3種植被群落：狗牙根、南狄和苔草，采樣時植被覆蓋)、河口(采樣時為入湖河水覆蓋)、泥灘(采樣時地表裸露無植被)和湖泊(采樣時為湖泊水體覆蓋)4種濕地類型土壤進行研究，每種類型各設(shè)置3個大樣地(圖1)，在每個樣地內(nèi)部設(shè)置3個平行樣方(1 m×1 m)，相鄰樣方相距200 m。根據(jù)五點混合采樣法用土鉆采集表層土壤樣品(0～20 cm)，共采集36個土壤樣品。樣品采集后，剔除殘留的草根和石礫，取部分土壤樣品自然風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)的測定，其余新鮮土壤裝于自封袋中保存在4 ℃冰箱，用于土壤微生物Biolog生態(tài)板培養(yǎng)分析。

表2 取樣地坐標(biāo)、時間及淹水狀態(tài)

1.3 樣品分析及方法

參照相關(guān)文獻[16-17]測定土壤理化性質(zhì)，其中土壤含水量(SM)采用烘干恒重法(105 ℃，8 h)；pH采用水浸提點位法(2.5:1的水土比)；土壤有機碳(SOC)采用重鉻酸鉀外加熱法；土壤總氮(TN)和總磷分別采用半微量凱式法和鉬銻抗比色法；土壤可溶性有機碳(SDOC)采用TOC儀法；微生物生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸—K2SO4(0.5 mol·L-1)浸提法。

土壤微生物碳源代謝特征的測定采用Biolog-Eco微平板法[18]。具體步驟：取10 g新鮮土壤放入250 mL形瓶中，加入90 mL 0.85% NaCl溶液，振蕩30 min，制備成土壤微生物懸浮液，靜置片刻吸取上清液并稀釋1000倍得到菌懸液。吸取150 μL的菌懸液接種在Biolog-Eco微平板中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)10 d。在培養(yǎng)過程中，每隔24 h通過Biolog自動讀數(shù)裝置讀取590 nm處的吸光值(OD)[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

選用120 h OD值分析土壤微生物對不同碳源的利用以及代謝功能多樣性的差異。首先將每孔OD值減去培養(yǎng)0 h的初始OD值，用以排除本底干擾[20]，然后計算平均每孔顏色變化率(Average well color development，AWCD)。同時參照文獻[21]選用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Evenness指數(shù)反應(yīng)微生物群落的代謝功能多樣性，計算方法如下：

AWCD=Σ(Ci-R)/31；

Shannon指數(shù)H′=1-∑(PilnPi)；

Evenness指數(shù)J=H′/lnS；

Simpson指數(shù)D=1-∑Pi2

式中：Ci表示每種碳源孔的OD值；R表示對照孔的OD值；Pi表示第i個非對照孔中的吸光值與所有非對照孔吸光值總和的比值；S為被利用的碳源總數(shù)。

此外，利用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行差異性分析和Pearson相關(guān)性分析。主成分分析(PCA)通過Canoco 5.0軟件完成。

2 結(jié)果及分析

2.1 不同景觀類型下的土壤理化性質(zhì)

不同濕地土壤類型的理化性質(zhì)和微生物生物量表現(xiàn)出不同的差異特征。由表3可見，土壤含水量(SM)由湖泊、河道、泥灘、草洲依次遞減，差異顯著(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，所有的濕地土壤均呈現(xiàn)出弱酸性，范圍在5.03～6.86之間，其中草洲土壤酸性最強，pH值為5.03，顯著低于其它3種濕地土壤(P<0.05)。對于土壤營養(yǎng)元素，草洲與湖泊濕地表現(xiàn)出更高的含量的SOC和TN，顯著高于泥灘和河口濕地土壤(P<0.05)，其中草洲與湖泊濕地SOC含量分別達到了12.993和14.93 g·kg-1，泥灘和河口濕地SOC分別為6.21和6.7 g·kg-1。而對于土壤TP，各土壤類型間并未表現(xiàn)出顯著差異。值得注意的是，對于土壤可溶性有機碳(SDOC)和微生物生物量碳(MBC)，草洲濕地土壤顯著高于其他3種濕地土壤(P<0.05)，分別高達106和462.19 mg·kg-1。

表3 土壤理化參數(shù)

2.2 土壤微生物利用碳源的動力學(xué)特征及功能多樣性分析

AWCD值體現(xiàn)了微生物群落對碳源利用的總體狀況。由圖2可知，不同濕地類型下土壤微生物AWCD值，培養(yǎng)時間的延長逐漸增大。在培養(yǎng)24 h內(nèi)變化不明顯，均小于0.1，培養(yǎng)24～120 h AWCD值迅速增大，微生物進入指數(shù)生長期，底物碳源被大量利用，120 h以后進入穩(wěn)定期，至240 h時達到平衡。據(jù)此，本研究有關(guān)微生物碳源利用的分析，均采用120 h時的AWCD值計算獲得。對比不同濕地類型土壤的AWCD值發(fā)現(xiàn)(表4)，草洲土壤微生物群落對底物碳源的總體利用能力最強，其次是河口，最后是湖泊和泥灘土壤(P<0.05)。

土壤微生物群落功能多樣性能夠反映群落整體的動態(tài)變化，代表了微生物群落數(shù)量分布和物種組成信息。多樣性指數(shù)分析表明(表4)，4種濕地土壤微生物群落功能多樣性存在顯著差異，其中草洲濕地土壤微生物3類多樣性指數(shù)顯著高于其他濕地土壤(P<0.05)。同時研究還發(fā)現(xiàn)，對于Shannon和Simpson指數(shù)而言，泥灘表現(xiàn)出更低功能多樣性。

表4 土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

2.3 土壤微生物對碳源的利用分析

Biolog-Eco微平板上31種碳源，分屬于6大類碳源，分別為聚合物類、碳水化合物類、酚酸類、羧酸類、氨基酸類和胺類。結(jié)果如圖(3)所示，鄱陽湖不同濕地土壤微生物對不同碳源相對利用率存在顯著差異?？傮w而言，4種濕地類型土壤均表現(xiàn)出對羧酸類、氨基酸類和胺類碳源利用的偏好性，占總碳原利用率的14.73%～26.69%；而對聚合物類和碳水化合物類表現(xiàn)較低的利用能力，占總碳原利用率的9.33%～14.64%。具體來看，與其他3種濕地土壤相比，草洲濕地土壤對聚合物類、碳水化合物類及酚酸類碳源具有更好的利用偏好性(P<0.05)，分別占總碳原利用率的14.65%，12.91%和20.08%；泥灘土壤微生物更傾向于利用氨基酸類碳源，占其總碳源利用率的26.69%；河口濕地土壤微生物傾向于利用酚酸類和胺類碳源，分別占其總碳原利用率的18.86%和23.56%；此外，湖泊濕地土壤微生物對羧酸類碳源有更好的利用傾向，占其總碳原利用率的22.14%。

2.4 不同濕地類型土壤微生物碳代謝圖譜主成分分析

對31種碳源的AWCD值進行主成分分析(圖4)。由圖可知，不同濕地土壤微生物的碳源利用能力有著顯著的分異情況。4種濕地土壤聚為3簇，其中草洲聚于PC1正半軸，泥灘聚于PC2正半軸，河口與湖泊聚為一簇，位于PC1和PC2的負(fù)半軸。初始載荷值反映了主成分分析圖上碳源利用的相關(guān)系數(shù)，載荷值越高表示對主成分貢獻越大。對篩選31種碳源中與每一主成分得分系數(shù)較高(載荷絕對值>1)的碳源進行分析(表5)。表5可以看出，與第1主成分PC1相關(guān)性較高的碳源有7種碳源，分屬于6類碳源，其中多聚物類1種、碳水化合物類2種、酚酸類1種、羧酸類2種、氨基酸類1種、胺類1類，表明草洲濕地土壤微生物大量的碳源代謝功能不同于其他濕地土壤。而與PC2相關(guān)性較高的碳源僅有4種，分屬于3類碳源，其中羧酸類2種、氨基酸類1種、胺類1種。表明泥灘、河口和湖泊濕地土壤碳源利用特征差異較小，主要體現(xiàn)在羧酸類、氨基酸類和胺類上。

表5 31種碳源的主成分載荷因子

2.5 環(huán)境因子對于微生物群落代謝功能影響分析

土壤物化環(huán)境決定了微生物的生長狀態(tài)和組成特征。經(jīng)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)(表6)，SM、pH與6類碳源的利用能力及3種微生物群落多樣性均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。值得注意的是，SOC、TN、TP作為土壤的主要營養(yǎng)元素，除SOC與碳水化合物呈顯著正相關(guān)外，與其他5種碳源利用及功能多樣性指數(shù)均無相關(guān)性(P>0.05)。然而對于土壤中最為活躍的碳組分SDOC和MBC而言，除MBC與胺類碳源、辛普森指數(shù)無相關(guān)性外，與其他碳源利用能力均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。表明，濕地土壤微生物對碳源的利用很少受土壤營養(yǎng)鹽總量的影響，而是受土壤中活性碳組分的影響。

表6 土壤理化性質(zhì)與微生物群落多樣性指數(shù)及利用不同碳源的相關(guān)性

3 討論

受水情驅(qū)動的影響，鄱陽湖濕地形成了以湖泊濕地為核心的多類型復(fù)合的微生物土壤生境，在不同的濕地類型中，土壤物化環(huán)境差異巨大[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，受土壤淹水條件的影響，常年積水的湖泊、河口濕地SM顯著高于周期性淹水的泥灘、草洲土壤(表3)。同時，草洲土壤的酸度更強，pH低至5.03，這可能是因為植被根系分泌物的釋放和殘體降解會生成一系列酸性代謝產(chǎn)物，從而降低了土壤pH[23]。在本研究中，湖泊和草洲濕地土壤中均表現(xiàn)出較高的SOC和TN含量，同時，相較于其他3類濕地土壤，草洲濕地土壤中還表現(xiàn)出更高的SDOC和MBC含量，分別達到了106和462.19 mg·kg-1(表3)。一般研究認(rèn)為，地上植被持續(xù)的向土壤中輸入有機質(zhì)是其維持高含量營養(yǎng)鹽的重要原因[24]。而對于湖泊濕地土壤，較高的碳氮含量得益于其獨特的土壤環(huán)境，湖泊濕地土壤一般處于淹水狀態(tài)，溫度低且變幅小，同時通氣性較差，抑制了好氧微生物的生長，致使土壤有機質(zhì)分解十分緩慢，逐漸形成了富含有機質(zhì)的濕地土壤，使其成為重要的碳匯[25]。對于同樣處于過濕狀態(tài)的河口和泥灘濕地土壤分別為粉砂質(zhì)粘土和砂質(zhì)壤土(表1)，較低的碳氮含量很可能是不同的土壤質(zhì)地導(dǎo)致的，有研究發(fā)現(xiàn)土壤中含有較高的砂粒不利于碳的儲存[26]。

本研究中，4種濕地類型土壤均表現(xiàn)出對羧酸類、氨基酸類和胺類碳源具有較強的利用能力(占總碳原利用率的14.73%以上)，而不善于利用聚合物類和碳水化合物類碳源(占總碳原利用率的14.64%以下)。這可能是由于濕地土壤一般處于濕潤或過濕狀態(tài)，形成的這種特殊的還原環(huán)境導(dǎo)致的，這在以往的研究中得到了證實[27]。微生物在不同的濕地土壤生境下，其功能特征出現(xiàn)了顯著的分異變化(圖4)。本研究中草洲濕地土壤微生物表現(xiàn)出了更高的碳源代謝潛力(AWCD)和功能多樣性(均勻度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù))。此外，相對其他濕地土壤微生物而言，草洲對聚合物類、碳水化合物類及酚酸類碳源具有更高的利用偏好性，分別占總碳原利用率的14.65%，12.91%和20.08%。以往的研究發(fā)現(xiàn)，地上植被產(chǎn)生的凋落物和根系分泌物在增加土壤有機碳和總氮的含量的同時，會加速土壤的物化循環(huán)，使得土壤微生物碳源代謝能力和利用碳源的多樣性較高[28]。此外，相對于其他濕地土壤，草洲濕地土壤遠(yuǎn)離湖心，地勢較高，淹水時長最短，因而其土壤環(huán)境更加適宜微生物的生長，生物活性更高，更加多樣[29]。同樣，對于相對干燥的草洲土壤(含水量顯著低于其他3種濕地土壤)，受水分條件的影響，土壤微生物更傾向于利用碳水化合物和聚合物類碳源，這在先前受控實驗的研究中已得到證實[17]。需要注意的是，在本研究中，選擇了3種植被覆蓋類型代表周灘濕地，雖然這在一定程度上能夠更全面的反映草洲濕地土壤微生物的功能代謝特征，但不同濕地植被下土壤物化性質(zhì)和微生物功能活性仍存在較強的異質(zhì)性[16]，因而，未來對湖泊濕地土壤微生物的研究還應(yīng)關(guān)注不同植被覆蓋類型帶來的影響。而對泥灘濕地碳代謝特征的研究中發(fā)現(xiàn)，土壤微生物更傾向于利用與氮相關(guān)的氨基酸類碳源(圖3)，占總碳源利用率的26.69%，這主要是由于泥灘土壤頻繁干濕交替的水環(huán)境決定的[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，對于同樣處于干濕交替的河岸帶土壤，具有更高的N去除潛力[31]。而對于常年淹水的河口和湖泊濕地，其土壤微生物功能代謝更加類似(圖3～4)，但仍表現(xiàn)出一定的差異特征，其中河口濕地土壤微生物對酚酸類和胺類碳源利用能力相對較強，分別占其總碳原利用率的18.86%和23.56%，而湖泊濕地土壤微生物對羧酸類碳源具有偏好性，占其總碳原利用率的22.14%。這主要是由于土壤中有機質(zhì)的來源不同造成的，酚類物質(zhì)和胺類物質(zhì)主要來源于人類的生產(chǎn)生活，在河流中有大量富集，這可能是造成河口濕地土壤較高利用能力的原因[32-33]。而對于湖泊濕地土壤，長期淹水形成的還原環(huán)境，厭氧微生物占據(jù)主導(dǎo)地位，其分解代謝途徑以發(fā)酵、乙?；純?yōu)勢，從而表現(xiàn)出對羧酸類碳源的偏好性[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同的濕地土壤微生物存在著顯著的碳代謝功能特征差異，這對維持整個湖泊濕地生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)功能的發(fā)揮極為重要。

土壤的物化環(huán)境是影響微生物生長代謝的關(guān)鍵因素。與以往研究類似[27,35]，土壤含水量和pH均是影響濕地土壤微生物碳源代謝功能的關(guān)鍵性因素(表6)。其中土壤含水量與土壤碳代謝活性及功能多樣性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，表明隨著濕地土壤含水量的降低，土壤活性逐漸增強，這不利于湖泊濕地土壤對碳的匯集。大量的研究發(fā)現(xiàn)，湖泊濕地土壤有機質(zhì)的積累得益于其過濕的水環(huán)境和還原條件，而干旱條件會增加土壤碳的釋放，與本研究結(jié)論一致[36]。一般認(rèn)為，微生物的生長代謝活性主要受土壤營養(yǎng)狀況的影響[37]。在本研究中，不同濕地土壤碳源代謝特征并不是受SOC、TN和TP的直接影響(P>0.05)，而是與土壤活性碳組分(SDOC和MBC)有很好的耦合關(guān)系。這可能是因為濕地土壤微生物更多的受土壤質(zhì)地和水環(huán)境的影響[38]。例如，湖泊濕地雖然擁有較高的營養(yǎng)(SOC和TN)物質(zhì)，但受長期淹水環(huán)境的影響，微生物代謝活性受到抑制。而SDOC和MBC作為土壤碳儲存庫中最活躍的組分，其含量大小反映土壤同化和礦化能力，是土壤微生物活性大小的標(biāo)志[39]，有研究基于微生物群落代謝預(yù)測發(fā)現(xiàn)，濕地土壤微生物的功能代謝特征主要受DOC的影響，與本研究結(jié)果類似[]。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，濕地土壤微生物群落代謝活性受土壤含水量和pH的負(fù)向影響，而與SDOC和MBC有很好地相關(guān)性。

4 結(jié)論

鄱陽湖不同濕地類型下土壤微生物的總體碳代謝能力不同，草洲濕地土壤微生物具有最高的碳代謝能力，其次是河口，最后是湖泊和泥灘濕地。此外，相較于其他3種濕地類型，草洲濕地土壤微生物具有更高的功能多樣性。

4種濕地類型土壤均表現(xiàn)出對羧酸類、氨基酸類和胺類碳源具有較強的利用能力(占總碳源利用率的14.73%～26.69%)。此外，不同濕地類型下土壤微生物對不同碳源具有一定的利用偏好差異，相對其他濕地土壤而言，草洲表現(xiàn)出對聚合物類、碳水化合物類及酚酸類碳源具有偏好性，分別占總碳原利用率的14.65%，12.91%和20.08%；泥灘更傾向于利用氨基酸類碳源，占其總碳源利用率的26.69%；河口傾向于利用酚酸類和胺類碳源，分別占其總碳源利用率的18.86%和23.56%；湖泊傾向于利用羧酸類碳源，占總碳原利用率的22.14%。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，濕地土壤微生物的碳源利用能力及功能多樣性受土壤含水量和pH的負(fù)向影響，受SDOC和MBC的正向影響。