劉夢

摘 要：以秘魯魷魚皮為原料，通過單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化法得到秘魯魷魚皮酸溶性膠原蛋白（acid soluble collagen，ASC）最佳提取工藝，并對ASC的理化特性進行研究。結(jié)果表明：最佳提取工藝為在4 ℃條件下，冰醋酸濃度0.47 mol/L、液料比24.5 mL/g，浸泡43 h后，ASC提取率為31.76%;紫外全波長掃描結(jié)果表明，所得ASC在231 nm波長處有最大吸收峰，符合Ⅰ型膠原蛋白特征;凝膠電泳分析表明，提取的ASC含有α1、α2和β鏈;拉曼光譜分析表明，所得ASC結(jié)構(gòu)完整，三螺旋結(jié)構(gòu)未受到破壞;ASC的相變溫度為50.07 ℃。

關(guān)鍵詞：秘魯魷魚皮;酸溶性膠原蛋白;提取;蛋白特性

Abstract： The extraction of acid soluble collagen （ASC） from jumbo squid skin was optimized using one-factor-at-a-time?method and response surface methodology （RSM）. Physiochemical properties of ASC were analyzed. The results demonstrated that the optimum extraction conditions that provided the maximum yield of ASC （31.76%） were determined as 4 ℃， 0.47 mol/L， 24.5 mL/g and 43 h for temperature， acetic acid concentration solvent-to-solid ratio and extraction time， respectively. The results of UV full wavelength scanning indicated that ASC had a maximum absorption peak at 231 nm wavelength， which was typical of type-Ⅰ collagen. In addition， the result of gel electrophoresis showed ASC contained α1， α2 and β chains. Moreover， Raman spectral analysis illustrated that the structural integrity of ASC was intact without any damage to its triple helical structure. The phase transition temperature of ASC was determined to be 50.07 ℃.

Keywords： jumbo squid （Dosidicus gigas） skin; acid soluble collagen; extraction; protein characteristics

秘魯魷魚（Dosidicus gigas）為大洋性淺海種，屬于莖柔魚屬，最大胴體長1.5 m，最大體質(zhì)量40 kg，在秘魯和智利沿岸及外海資源豐富，資源量700～1 000 萬t。魷魚因其豐富的營養(yǎng)價值，深受消費者喜愛。目前，市場上的魷魚制品是將魷魚去皮、去頭及去內(nèi)臟后，加工成速凍產(chǎn)品或即食食品，而小部分加工副產(chǎn)物用以加工制作成動物飼料，其余大部分則被丟棄，造成資源浪費和環(huán)境污染。魷魚加工副產(chǎn)物中魷魚皮所占比重最大，約占魷魚總質(zhì)量的10%[1-2]。魷魚皮中富含大量膠原蛋白，具有美容、調(diào)節(jié)免疫力、降血壓、抗氧化等作用。

目前，有關(guān)魚皮膠原蛋白提取的文獻較多，尤其是羅非魚[3-4]、鱈魚[5-6]、馬面魚[7-8]等，有關(guān)魷魚皮膠原蛋白的提取近年來也有報道。但魷魚皮膠原蛋白提取大多采用酶提法，得到膠原蛋白肽[9-10]，采用酸提法得到酸溶性膠原蛋白（acid soluble collagen，ASC）且對提取條件進行優(yōu)化的報道較少。

本研究采用酸提法提取秘魯魷魚皮中的ASC，通過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化法，確定魷魚皮中ASC的最佳提取工藝，并對所提取的ASC特性進行分析，以期得到提取率高、結(jié)構(gòu)完整的魷魚皮膠原蛋白，為魷魚皮的綜合利用提供理論基礎(chǔ)，提升水產(chǎn)品副產(chǎn)物價值，減少資源浪費。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秘魯魷魚皮 北京市北水嘉倫水產(chǎn)品市場有限責任公司。

氫氧化鈉、正丁醇、冰乙酸、氯化鈉、四甲基乙二胺、過硫酸銨、考馬斯亮藍R-250（均為分析純）?國藥集團化學試劑有限公司;30 g/100 mL聚丙烯酰胺儲備液、1.0 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、1.5 mol/L?Tris-HCl（pH 8.8）、10 g/100 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（含0.125 mol/L Tris、1.25 mol/L甘氨酸、0.5 g/100 mL SDS）、5×SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（含10 g/100 mL SDS、0.25 mol/L?Tris-HCl（pH 6.8）、體積分數(shù)50%甘油、0.5 g/100 mL溴酚藍、5 g/100 mL β-巰基乙醇） 北京蘭杰柯科技有限公司;蛋白Marker（11～245 kDa） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6050真空干燥箱 北京萊凱博儀器設(shè)備有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 默克密理博實驗室設(shè)備（上海）有限公司;Sorvall LYNX-6000離心機 美國賽默飛世爾科技公司;UV-2800紫外-可見分光光度計?美國尤尼柯公司;DYCZ-24KS凝膠電泳槽 北京六一生物科技有限公司;PowerPac Universal電泳儀電源、Gel Doc XR+凝膠成像儀（配Image Lab Software）?美國Bio-Rad公司;TS-200搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;XploRA Plus拉曼光譜儀 日本Horiba公司;Q200差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 秘魯魷魚皮基本成分測定

水分含量測定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》[11];蛋白質(zhì)含量測定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》[12];脂肪含量測定：參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[13];灰分含量測定：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》[14]。

1.3.2 秘魯魷魚皮預(yù)處理

將秘魯魷魚皮置于4 ℃冷庫中解凍，至中心溫度達到0 ℃以上;將解凍后的秘魯魷魚皮用超純水洗凈后，切成1.0 cm×1.0 cm，4 ℃貯藏備用。

參考Matmaroh等[15]的方法，取適量秘魯魷魚皮用超純水沖洗干凈，在4 ℃條件下，以液料比20 mL/g加入0.1 mol/L NaOH溶液浸泡20 h，以除去秘魯魷魚皮中的非膠原蛋白;然后用超純水沖洗秘魯魷魚皮至pH值中性，瀝干后，以液料比10 mL/g加入10 g/100 mL正丁醇溶液，攪拌浸泡20 h，以除去秘魯魷魚皮中的脂肪，然后用超純水沖洗魷魚皮至中性，瀝干，備用。

1.3.3 秘魯魷魚皮ASC的提取

參考Wu Xiaosa等[16]的方法，取100 g預(yù)處理后的秘魯魷魚皮，按一定的液料比加入一定濃度的冰醋酸，在4 ℃條件下攪拌浸泡一定時間后，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液，將未提取完全的秘魯魷魚皮再次用等體積同濃度冰醋酸提取，合并上清液;向上清液中加入一定量的NaCl，至NaCl終濃度為0.9 mol/L，靜置4 h;在4 ℃條件下5 000 r/min離心20 min，棄上清液;將沉淀溶于相同濃度的冰醋酸，在4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min，除去不溶性雜質(zhì);將上清液放入透析袋中，在4 ℃條件下進行透析，每8 h換1 次超純水，透析2 次，對透析后的膠原蛋白溶液進行冷凍干燥，得到ASC。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

1.3.4.1 冰醋酸濃度對ASC提取效果的影響

設(shè)置液料比為10 mL/g，浸泡時間為24 h，研究不同濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L）冰醋酸對ASC提取效果的影響。

1.3.4.2 浸泡時間對ASC提取效果的影響

設(shè)置冰醋酸濃度為0.5 mol/L，液料比為10 mL/g，研究不同浸泡時間（12、24、36、48、60 h）對ASC提取效果的影響。

1.3.4.3 液料比對ASC提取效果的影響

設(shè)置冰醋酸濃度為0.5 mol/L，浸泡時間為24 h，研究不同液料比（10、15、20、25、30 mL/g）對ASC提取效果的影響。

1.3.5 秘魯魷魚皮ASC提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗確定各因素的取值范圍，結(jié)合Box-Behnken試驗原理，以冰醋酸濃度、浸泡時間和液料比為自變量，以ASC提取率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，Box-Behnken設(shè)計因素水平及編碼如表1所示。

1.3.6 ASC提取率測定羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》[17]測定羥脯氨酸含量，膠原蛋白含量通過羥脯氨酸含量乘以換算系數(shù)11.1得到[3]。本研究通過羥脯氨酸含量計算ASC提取率。ASC提取率按下式計算。式中：C為ASC中羥脯氨酸含量/%;C0為秘魯魷魚皮中羥脯氨酸含量/%。

1.3.7 ASC特性分析

對采用優(yōu)化工藝提取的ASC進行蛋白特性分析。

1.3.7.1 紫外全波長掃描

參考Jeevithan等[18]的方法，稍作修改。取0.1 g ASC溶于100 mL 0.1 mol/L冰乙酸溶液中，得到1 mg/mL ASC溶液，以0.1 mol/L冰乙酸作為空白對照;在190～400 nm波長范圍內(nèi)對ASC溶液進行掃描。

1.3.7.2 SDS-PAGE分析

參考Laemmli[19]的方法，稍作修改。取0.2 g ASC溶于100 mL 0.1 mol/L冰乙酸溶液中，得到2 mg/mL ASC溶液，取0.4 mL ASC溶液與0.1 mL上樣緩沖液混合，沸水浴3～5 min;采用8 g/100 mL分離膠和5 g/100 mL濃縮膠，取20 μL ASC溶液與5 μL蛋白Marker上樣，采用直流恒壓電源，濃縮膠電壓為90 V，進入分離膠后電壓調(diào)至120 V，結(jié)束后取出電泳膠進行染色，染色30 min后脫色2 h，脫色后采用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。

1.3.7.3 拉曼光譜掃描

參考曹錦軒等[20]的方法。取0.2 g ASC溶于100 mL 0.1 mol/L冰乙酸溶液中，得到2 mg/mL ASC溶液，用50 倍鏡頭將激光聚焦于載玻片上的ASC溶液，采用532 mm離子激光器，分辨率1 cm-1，獲取400～2 800 cm-1的拉曼光譜，并用Labspcc對光譜進行多點基線校正，去除熒光背景。

1.3.7.4 DSC分析

參考紀倩等[21]的方法。取3～5 mg ASC置于坩堝內(nèi)，壓蓋，以空白坩堝作為參比。溫度掃描范圍20～200 ℃，升溫速率5 ℃/min，記錄吸熱曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 10.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，每個樣品重復測定3 次，實驗結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 秘魯魷魚皮基本成分

由表2可知，秘魯魷魚皮中含有大量水分，其次是蛋白質(zhì)，約占干物質(zhì)的90%，這與魏薇薇等[2]的闡述一致。通過GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》測得秘魯魷魚皮中羥脯氨酸的含量為1.17%，膠原蛋白含量為12.99%，占蛋白質(zhì)總量的70.75%，可見秘魯魷魚皮中膠原蛋白含量較高，是一種提取水產(chǎn)膠原蛋白的優(yōu)質(zhì)原料。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 冰醋酸濃度對ASC提取效果的影響試驗結(jié)果

由圖1可知，隨著冰醋酸濃度增加，ASC提取率呈先上升后下降的趨勢，冰醋酸濃度為0.5 mol/L時ASC提取率最高，為18.57%。這可能是由于低pH值有利于ASC的溶出，但pH值過低會造成蛋白質(zhì)變性，影響提取效率。因此，選擇0.3、0.5、0.7 mol/L 3 個濃度進行響應(yīng)面試驗。

2.2.2 浸泡時間對ASC提取效果的影響試驗結(jié)果

由圖2可知，隨著浸泡時間的延長，ASC提取率逐漸增加。浸泡時間為12～36 h時，ASC提取率增加較快;36 h后，ASC提取率增加較慢，提取率為19.38%～20.02%。因此，選擇浸泡時間24、36、48 h進行響應(yīng)面試驗。

2.2.3 液料比對ASC提取效果的影響試驗結(jié)果

由圖3可知，隨著液料比的增加，ASC提取率逐漸上升。液料比10～20 mL/g時，ASC提取率增加明顯;液料比高于20 mL/g時，ASC提取率增加緩慢，提取率為25.40%～26.14%。因此，選擇液料比為15、20、25 mL/g進行響應(yīng)面試驗。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化ASC提取工藝結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

按照Box-Behnken中心組合設(shè)計響應(yīng)面試驗，結(jié)果如表3所示。利用Design Expert 10.0軟件對數(shù)據(jù)進行擬合，得到冰醋酸濃度（A）、浸泡時間（B）、液料比（C）對秘魯魷魚皮ASC提取率的標準回歸方程為Y=29.04-0.82A+1.21B+3.07C-0.31AB+0.45AC+0.92BC-1.85A2-1.85B2-1.96C2。

可知，模型P<0.000 1，說明模型極顯著，失擬項P=0.205 9>0.05，不顯著，說明模型擬合程度良好。相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6，說明模型很好地解釋了99.86% ASC提取率的變化，各因素間線性相關(guān)性好，實驗誤差小。從各項系數(shù)的顯著性分析檢驗可以看出，各項對ASC提取率的影響均極顯著。

2.3.3 ASC提取工藝最佳條件

經(jīng)過優(yōu)化分析，得到秘魯魷魚皮ASC的最佳提取工藝為冰醋酸濃度0.47 mol/L、浸泡時間42.80 h、液料比24.49 mL/g，得到的理論提取率為30.82%。結(jié)合實驗的可操作性，將提取條件優(yōu)化為冰醋酸濃度0.47 mol/L、浸泡時間43 h、液料比24.50 mL/g，在此條件下得到的實際提取率為（31.76±0.26）%，與理論值相差0.94%，證明該模型的擬合度良好，可以通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)得到最佳工藝參數(shù)。

2.4 ASC特性分析

2.4.1 紫外全波長掃描結(jié)果

蛋白質(zhì)大多富含色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在280 nm波長處存在明顯的紫外吸收峰[22]。但膠原蛋白基本不含這些芳香族氨基酸，因此在280 nm波長處無明顯吸收峰，但其富含羥脯氨酸和脯氨酸，使得膠原蛋白在230 nm波長左右有明顯的紫外吸收峰。因此，可以通過紫外吸收光譜對膠原蛋白進行分析。

由圖7可知，采用優(yōu)化后工藝提取的秘魯魷魚皮ASC在231 nm波長處存在明顯吸收峰，而在280 nm波長處無明顯吸收，這可能是C=O的n→π*躍遷，且樣品中芳香族氨基酸含量很低所致[23]。這與鮑虹蕾[3]、Tamilmozhi[24]等報道的魚類Ⅰ型膠原蛋白特性分析結(jié)果相一致。

2.4.2 SDS-PAGE分析結(jié)果

由圖8可知，秘魯魷魚皮ASC中存在α鏈和β鏈，其中α鏈2 條，分別為α1鏈和α2鏈，分子質(zhì)量120 kDa左右。分子質(zhì)量200 kDa附近存在1 條明顯的β鏈，β鏈為α鏈的二聚體，說明ASC分子中存在分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)作用[25]。但β鏈上方未出現(xiàn)γ鏈，說明ASC樣品中γ鏈含量非常低。圖中α2鏈條帶下方無其他條帶，說明本方法提取的ASC純度較高。

2.4.3 拉曼光譜掃描結(jié)果

拉曼光譜中酰胺Ⅰ帶位于1 650 cm-1附近[26]，主要反映肽鍵C=O的面內(nèi)伸縮振動，是膠原蛋白分子二級結(jié)構(gòu)的特征吸收[27];酰胺Ⅲ帶主要分布于1 230～1 350 cm-1[28]，由C-N的伸縮振動和N-H平面內(nèi)的彎曲引起，歸屬于甘氨酸骨架和脯氨酸側(cè)鏈的-CH2搖擺[26]。

由圖9可知，秘魯魷魚皮ASC的酰胺Ⅰ帶和Ⅲ帶分別出現(xiàn)在1 644.78、1 322.79 cm-1處，且酰胺Ⅰ帶和Ⅲ帶之間存在1 個明顯的吸收峰，該吸收峰表明樣品中螺旋結(jié)構(gòu)的存在[29-30]，說明本方法提取的ASC結(jié)構(gòu)完整，三螺旋結(jié)構(gòu)未受到破壞。

2.4.4 DSC分析結(jié)果

在較高溫度下，膠原纖維發(fā)生收縮，膠原蛋白的結(jié)構(gòu)會被破壞，通過DSC可以分析升溫過程中膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)變成無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)時的熱收縮溫度。

由圖10可知，DSC曲線中存在1 個放熱峰，表明ASC在此存在相變，相變溫度為50.07 ℃，此時相變放熱量為306.3 J/g。研究表明，亞氨基酸吡咯環(huán)形成的非共價鍵有助于膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，因此，羥脯氨酸和脯氨酸含量與膠原蛋白熱穩(wěn)定性密切相關(guān)[31]。本方法提取的魷魚皮ASC熱穩(wěn)定性與已報道的水產(chǎn)膠原蛋白特性相一致[32-33]。

3 結(jié) 論

以秘魯魷魚加工副產(chǎn)物魷魚皮為原料，以ASC提取率為指標，對冰醋酸濃度、液料比和浸泡時間進行單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化，得到秘魯魷魚皮ASC最佳提取工藝。通過紫外全波長掃描、SDS-PAGE、拉曼光譜及DSC測定提取的ASC特性，發(fā)現(xiàn)采用最佳工藝提取的ASC屬于典型的Ⅰ型膠原蛋白，含有α1、α2和β鏈，且蛋白結(jié)構(gòu)完整，三螺旋結(jié)構(gòu)未被破壞，其熱變性溫度為50.07 ℃。本研究可為制備水產(chǎn)膠原蛋白包裝材料提供理論依據(jù)，并為秘魯魷魚皮進一步加工利用提供參考，進而提高秘魯魷魚副產(chǎn)物價值，減少資源浪費。

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