體外模擬胃腸消化過程中獼猴桃抗氧化成分及活性的變化

王 靜，韓 瑩，羅 茜，劉 洋，陳雪峰

（陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安710021）

獼猴桃營養(yǎng)價值高，富含多種礦物質(zhì)、維生素、氨基酸等基本營養(yǎng)素以及多酚、黃酮等多種具有抗氧化活性的物質(zhì)，能為人類健康帶來諸多益處[1-2]。

正常機(jī)體氧化還原是處于一種穩(wěn)定狀態(tài)，若此平衡狀態(tài)失衡會導(dǎo)致細(xì)胞組織氧化損傷，危害機(jī)體健康。因此，控制自由基的產(chǎn)生并有效提高抗氧化能力一直是研究熱點(diǎn)[3-4]，而食物中的抗氧化活性物質(zhì)備受國內(nèi)外學(xué)者青睞。目前有關(guān)物質(zhì)活性成分的研究，傳統(tǒng)研究方法采用的大多是以化學(xué)溶劑提取原料中的活性成分從而得到所需數(shù)據(jù)，但由于機(jī)體是復(fù)雜環(huán)境這一客觀事實(shí)，該法未能揭示活性成分在人體胃腸道中的消化過程以及消化進(jìn)程中可能出現(xiàn)的種種變化，對活性物質(zhì)的真實(shí)代謝、變化規(guī)律不能完全揭示，所以得到的研究結(jié)果雖具有一定價值但仍需其他研究方法進(jìn)行補(bǔ)充。體外模擬胃腸消化法能夠?qū)⑷梭w的胃腸道環(huán)境更加真實(shí)模擬出來，所得結(jié)果與食品在人體的真實(shí)內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生的變化基本相符，且實(shí)驗(yàn)周期短，重現(xiàn)性好，節(jié)省材料，方便易操作。因此，采用體外模擬胃腸消化法對食品的抗氧化活性進(jìn)行評估比傳統(tǒng)化學(xué)方法更為科學(xué)[5-8]。

目前有關(guān)獼猴桃活性成分以及抗氧化的研究很多[1，9-10]，但基于體外模擬胃腸消化評估其抗氧化活性的研究卻非常罕見[11]。因而，選擇獼猴桃作為本次試驗(yàn)的研究材料，采用體外胃腸模擬消化體系，分別檢測胃腸消化前后獼猴桃中的多酚和黃酮類物質(zhì)的釋放量，比較胃腸消化前后獼猴桃抗氧化活性產(chǎn)生的變化，并對其變化規(guī)律做出分析，為完善獼猴桃的體內(nèi)代謝研究提供依據(jù)，對豐富果蔬營養(yǎng)健康理論及指導(dǎo)獼猴桃資源的合理開發(fā)利用都具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

徐香獼猴桃：購于陜西省眉縣農(nóng)貿(mào)市場；福林-酚試劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購自天津天力化學(xué)試劑有限公司；Tris-HCL、DPPH·、胃蛋白酶、胰蛋白酶：購于廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司；豬膽鹽：購于北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ·82A水浴恒溫振蕩器：上海博珍儀器設(shè)備制造廠制造；GT15RT臺式冷凍離心機(jī)：上海浦東天本離心機(jī)械有限公司產(chǎn)品；MJ-BL25B2榨汁機(jī)：美的集團(tuán)產(chǎn)品；varioskan flash全波長掃描式多功能酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技有限公司（芬蘭）產(chǎn)品；ST3100 pH計(jì)：奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備獼猴桃果漿（原漿）：獼猴桃去皮后果肉與0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl混合，榨汁機(jī)打碎，制成勻漿液樣品。

獼猴桃果汁：將果漿離心后取上清液加入等量蒸餾水稀釋為果汁樣品。

1.3.2 體外模擬胃腸消化模擬胃液[12]：將10 g胃蛋白酶充分溶解于濃度為2.75 mol/L HCl中，加蒸餾水定容至1 L，并調(diào)節(jié)溶液至最終pH值為1.3。

模擬腸液[13]：將10 g胰蛋白酶及25 g豬膽鹽溶液充分溶解于0.1 mol/L NaHCO3中，加蒸餾水定容至1 L，并調(diào)節(jié)溶液最終pH值為7。

模擬胃消化：37℃水浴處理待測樣品，加入模擬胃液定容至1 L，HCl調(diào)節(jié)樣品溶液pH值至1.3，恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行消化，消化條件為37℃、100 r/min。

模擬腸消化；取胃消化2.0 h后的樣品，加入模擬腸液定容至1 L，NaHCO3調(diào)節(jié)待測樣品溶液pH值7，放入恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行消化，消化條件與模擬胃消化相同。

1.3.3 抗氧化活性物質(zhì)含量測定多酚：多酚含量以福林-肖卡法測定[14]。以沒食子酸（色譜純）做標(biāo)曲，測定結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量（mg）/鮮質(zhì)量（g）進(jìn)行表示。

總類黃酮：總類黃酮含量以氯化鋁-亞硝酸鈉比色法測定[15]。以蘆?。ㄉV純）做標(biāo)曲，測量結(jié)果以蘆丁質(zhì)量（mg）/獼猴桃鮮質(zhì)量（kg）表示。

1.3.4 抗氧化活性

1)DPPH自由基清除率 參考相關(guān)文獻(xiàn)[16]中的方法，對DPPH自由基清除率進(jìn)行檢測。取樣品溶液與DPPH-乙醇溶液（0.2 mmol/L）各2 mL混合，避光處靜置反應(yīng)30 min，空白組中樣品以蒸餾水代替，對照組中DPPH-乙醇溶液以乙醇代替，測定OD517nm（OD值以A表示）。按式（1）計(jì)算測樣品中的DPPH自由基清除率

式中，C為DPPH自由基清除率；A0為空白組（無樣品）測量值；A1為試驗(yàn)組（加樣品和試劑）測量值；A2為對照組（無試劑）測量值。

2）超氧陰離子自由基清除率 參考相關(guān)文獻(xiàn)[17]中的方法并做相應(yīng)調(diào)整，25℃水浴處理3 mL Tris-HCl緩沖液20 min，結(jié)束后加入樣品1 mL，7 mmol/L鄰苯三酚溶液3 mL，濃鹽酸1 mL；空白組中樣品以蒸餾水代替，對照組中鄰苯三酚溶液以蒸餾水代替，混勻，測定OD420nm。按式（1）對超氧陰離子自由基清除率進(jìn)行計(jì)算。

3)鐵離子還原力 取15 mL的離心管，加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液，不同濃度的樣品液和1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鐵氰化鉀溶液各2 mL，50℃水浴20 min后迅速冷卻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸（TCA）2 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL置于比色管，加2 mL蒸餾水及質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵0.4 mL，混合均勻，反應(yīng)10 min，對照組加入2.4 mL蒸餾水，測定OD700nm。

4)羥自由基清除率[18]水楊酸法可以有效鑒定體系中的羥自由基，向試管中加入待測樣品2 mL（空白組不加），按序加入6 mmol/L FeSO4溶液（對照組不加）、2.5 mmol/L H2O2溶液各2 mL（對照組不加），靜置10 min，繼續(xù)加入6 mmol/L水楊酸乙醇溶液2 mL（對照組不加），蒸餾水定容至10 mL，37℃水浴30 min，水浴完成后，3 000 r/min離心10 min，取上清液測定OD510nm。照公式（1）對羥自由基清除率進(jìn)行計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

所有試驗(yàn)均設(shè)3組平行，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與差異性分析，與同組數(shù)據(jù)中消化0.5 h組比較，*差異顯著（P＜0.05），**差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚含量

廣泛存在于植物中的酚類化合物，由于其羥基取代的高反應(yīng)性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性，因此通過對樣品多酚含量的測定可以反映其抗氧化性的強(qiáng)弱。

圖1為果漿和果汁在不同消化時間里多酚釋放量的變化情況，以消化組相對于未消化組的釋放倍數(shù)作圖可以直觀地表現(xiàn)出兩者的變化過程。

圖1 果漿及果汁消化后多酚釋放量Fig.1 Total polyphenol content in pulp and juice after digestion

由圖1可知，胃腸消化可以促進(jìn)獼猴桃多酚的釋放。獼猴桃果漿中多酚在模擬胃消化的0.5、1、2、3 h多酚釋放量分別是未消化組的1.05、1.26、1.24、1.28倍，在模擬腸消化的0.5、1、2、3 h多酚釋放量分別是未消化組的1.42、1.62、1.38、1.34倍。獼猴桃果汁在模擬胃消化0.5、1、2、3 h多酚的釋放量分別是未消化組的1.19、1.67、1.59、1.58倍，在腸消化0.5、1、2、3 h多酚的釋放量分別是未消化組的2.74、2.89、2.67、2.70倍。結(jié)果表明，模擬腸消化組釋放量大于胃消化組釋放量，在腸液環(huán)境，胰酶可能繼續(xù)使結(jié)合態(tài)多酚釋放為游離態(tài)，因而含量有所增加。在胃消化1 h多酚釋放量最多，在2 h以后基本保持穩(wěn)定。腸消化階段，果汁、果漿均在消化1 h時多酚釋放量最多，1 h以后降低，2 h后多酚釋放量基本穩(wěn)定。果漿和果汁組，多酚釋放量的變化規(guī)律基本一致。無論是腸消化還是胃消化，在消化1 h達(dá)到峰值后均會開始呈一定程度的下降趨勢，這可能是隨著消化時間的延長，一些穩(wěn)定性差的多酚發(fā)生降解。而消化2 h后多酚含量基本穩(wěn)定，可能是因?yàn)榻Y(jié)合態(tài)多酚的釋放和降解已經(jīng)平衡。

2.2 總類黃酮含量

獼猴桃果漿和果汁分別通過胃、腸消化階段進(jìn)行不同時間的消化后，總類黃酮含量的變化如圖2所示。

圖2 果漿及果汁消化后總類黃酮釋放量Fig.2 Total flavonoids content in pulp and juice after digestion

由圖2可見，獼猴桃果漿在模擬胃消化0.5、1、2、3 h類黃酮的釋放量分別是未消化組的1.19、1.54、1.27、1.36倍。模擬腸消化0.5、1、2、3 h類黃酮的釋放量分別是未消化組的1.82、2.04、1.92、1.94倍。獼猴桃果汁在模擬胃消化0.5、1、2、3 h類黃酮的釋放量分別是未消化組的1.20、1.67、1.58、1.58倍，在模擬腸消化0.5、1、2、3 h類黃酮的釋放量分別是未消化組的2.73、2.90、2.67、2.70倍。結(jié)果表明，腸消化組釋放量大于胃消化組釋放量，腸消化促進(jìn)黃酮類物質(zhì)的釋放。經(jīng)過胃消化以及腸消化后，獼猴桃類黃酮釋放量在消化1.0 h內(nèi)明顯升高，隨后基本穩(wěn)定。黃酮的變化與多酚的變化相似。

胃蛋白酶、胰酶在水解獼猴桃中的蛋白質(zhì)時，破壞蛋白質(zhì)與多酚、黃酮之間的化學(xué)鍵，釋放結(jié)合態(tài)多酚、黃酮；獼猴桃中含的原花青素等，在較低的pH環(huán)境更易水解，也可能對多酚物質(zhì)的水溶性有一定的提高作用，所得結(jié)果與JAYAWARDENA[19-20]等報(bào)道一致。

在模擬消化過程中，隨著消化時間的延長，多酚、黃酮可能開始降解導(dǎo)致含量減少。腸液環(huán)境可能也不利于酸性多酚存在，只能通過降解、氧化或異構(gòu)等途徑轉(zhuǎn)化。此過程中總黃酮含量降低，可能是因?yàn)榉€(wěn)定性較差的原花青素、花色苷等出現(xiàn)部分降解[21-23]。

2.3 DPPH自由基清除率

獼猴桃果漿和果汁通過胃腸消化階段進(jìn)行不同時間的消化后，DPPH自由基清除率的變化情況如圖3所示。

圖3 果漿和果汁DPPH自由基清除率Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of pulp and juice

生物體內(nèi)存在抗氧化防御系統(tǒng)來維持氧化和抗氧化體系的動態(tài)平衡。而當(dāng)各種因素打破這一平衡時，過量自由基就會引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，導(dǎo)致衰老和一系列病理過程。DPPH自由基體系是體外評判抗氧化物質(zhì)清除自由基能力的常用體系。DPPH自由基是以氮為中心的自由基，在517 nm處有一特征吸收峰，向DPPH自由基溶液中加入抗氧化物質(zhì)，孤對電子被配對，致使其最大吸收波長處的吸收消失或減弱。因此，通過測定吸收減弱的程度，可以評價抗氧化物質(zhì)的活性強(qiáng)弱。

由圖3可見，在模擬胃消化過程中，果漿和果汁的DPPH自由基清除率均在胃消化1 h內(nèi)顯著升高并達(dá)到最大值（（89.44±0.50）%、（88.90±0.63）%），然后下降并趨于穩(wěn)定。而模擬腸消化，消化0.5 h的樣品其自由基清除率明顯低于胃消化組，消化1 h達(dá)最大值，隨后略微下降趨于穩(wěn)定（50%～60%）。

對比發(fā)現(xiàn)，腸消化樣品的DPPH自由基清除率較胃消化樣品有所下降，而圖1和圖2結(jié)果卻顯示，腸消化后，多酚、黃酮含量有所增加，這與圖3結(jié)果看似相悖，但卻也是合理的。因?yàn)楂J猴桃除了多酚、黃酮，還含有其他抗氧化活性成分如維生素、多糖和有機(jī)酸[24]。DPPH自由基清除能力表征的是樣品中所有具有DPPH自由基清除活性的抗氧化成分的綜合效果。雖然腸消化過程中，多酚、黃酮含量較高，但腸液環(huán)境中，有機(jī)酸并不能大量穩(wěn)定存在。而多糖組成的糖苷鍵連接，以及結(jié)構(gòu)修飾基團(tuán)等，都對酸堿環(huán)境敏感[25]。對自由基清除能力有貢獻(xiàn)的其他成分可能被降解或破壞，最終總的自由基清除能力下降。此外，也有研究表明，抗氧化活性物質(zhì)同時存在時，并不是簡單的加和增效，可能存在相互影響，如蛋白質(zhì)、多糖與多酚之間涉及的共價鍵與非共價鍵的相互作用影響多酚抗氧化活性和蛋白質(zhì)糖基化。而李俶等[26]研究發(fā)現(xiàn)，酚類化合物單體混合后，胃腸道消化對其作用均有一定程度的影響，特別是模擬腸消化對各酚類化合物的影響明顯不同。獼猴桃消化過程中，特別是在腸消化液中各種抗氧化物質(zhì)之間可能也存在類似的相互作用，從而導(dǎo)致自由基清除能力下降，具體原因有待后續(xù)進(jìn)一步探究。

2.4 超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子自由基是氧在生物體內(nèi)形成的第一個氧自由基，除了自身的毒性危害，它還可以經(jīng)一系列反應(yīng)衍生為其他活性氧，如羥基和過氧化氫，進(jìn)一步損傷生物體。

獼猴桃果漿和果汁進(jìn)行胃腸消化后，兩者對超氧陰離子自由基清除率的變化情況如圖4所示。在消化1 h時，胃、腸消化組樣品的自由基清除率均達(dá)到最大值。之后，胃消化組基本保持穩(wěn)定，腸消化組持續(xù)下降且降幅明顯。胃消化組超氧陰離子自由基清除率大于腸消化組。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與DPPH自由基（見圖3）的結(jié)果基本一致，可能是樣品中含有其他抗氧化活性成分造成的，如有機(jī)酸[27]、維生素、多糖等。所以經(jīng)胃腸消化后，雖然樣品中的多酚和黃酮類物質(zhì)都得到釋放，但在偏中性的腸液中有機(jī)酸發(fā)生降解，同時多糖、維生素C、維生素E與多酚類化合物形成的協(xié)同抗氧化也受到影響[28-29]。因此，腸消化組的超氧陰離子自由基清除能力下降。

圖4 果漿和果汁超氧陰離子自由基清除率Fig.4 Superoxide anion radical scavenging capacity of pulp and juice

果漿組和果汁組由于實(shí)驗(yàn)有效成分濃度不統(tǒng)一，沒有可比性，但是圖1和圖2結(jié)果得出，在腸消化液中，果汁中多酚、黃酮的含量高于果漿組，但DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除率卻得出了相反的結(jié)果，這可能是由于果汁中含有更多的游離酚，這些酚類物質(zhì)之間相互作用，影響了總的自由基清除效果，而果漿保留了更多的果肉，保留了結(jié)合形式的活性成分，在腸中易分解、解離出來，從而使得果漿腸消化后自由基清除活力增加。

2.5 羥自由基清除率

機(jī)體內(nèi)90%以上的自由基屬于氧自由基，其中羥自由基（·OH）的化學(xué)性質(zhì)最為活潑，具有極強(qiáng)的氧化能力，可通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式氧化損傷生物體內(nèi)的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等多種分子，與衰老、腫瘤、輻射損傷等密切相關(guān)[19]。

圖5為獼猴桃果漿和果汁分別進(jìn)行不同時間的胃、腸模擬消化后，清除羥自由基的變化情況。由圖5可知，模擬胃消化后，羥自由基清除率在消化1 h的樣品清除率最大，而后隨時間增加，果漿組清除率基本穩(wěn)定，果汁組清除率降低且降幅明顯。模擬腸消化，果漿組與果汁組自由基清除率略有升高，隨后略微降低?？傮w而言，同等消化條件下，果漿組羥自由基清除率大于果汁組羥自由基清除率，和超氧陰離子自由基、DPPH自由基研究結(jié)果一致。不同的是，腸消化組羥自由基清除率大于胃消化組羥自由基清除率，而引起這一現(xiàn)象的原因，一方面是因?yàn)槟c液消化后，多酚、黃酮釋放量增加；另一方面也可能是由于模擬胃液強(qiáng)酸環(huán)境影響羥自由基與活性物質(zhì)的電子轉(zhuǎn)移，從而抑制了樣品清除羥自由基的能力，封易成[27]和從彥麗等[30-31]也報(bào)道了相似的研究結(jié)果。

圖5 果漿和果漿羥自由基清除率Fig.5 Hydroxyl radical scavenging capacity of pulp and juice

2.6 鐵離子還原力

鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP）和以上方法不同，它并不針對某一種自由基，而是反映樣品總抗氧化活性。其檢測原理是抗氧化物質(zhì)將三價鐵還原為二價鐵，二價鐵與2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ）生成藍(lán)色物質(zhì)，在593 nm處有最大吸收。吸光度與抗氧化劑的還原能力呈正相關(guān)，吸光度越大表明物質(zhì)具有越高的抗氧化活性[32-33]。

獼猴桃果漿和果汁分別進(jìn)行胃、腸消化階段的模擬消化，在不同時間內(nèi)鐵還原力的變化如圖6所示。模擬胃消化后，果漿組和果汁組樣品的還原力在消化1 h時達(dá)到最大值，而消化2、3 h后還原力有所下降。模擬腸消化后，果漿組樣品也呈現(xiàn)了與胃消化變化相似的趨勢，而果汁組樣品的鐵還原力基本穩(wěn)定。此外，同等消化條件下，果漿組鐵還原力大于果汁組，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前述自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。而腸消化組樣品還原力大于胃消化組樣品還原力，這個變化與羥自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合，這也與多酚、黃酮在腸液中的高含量相吻合。雖然，王華等[34]研究表明獼猴桃丙酮提取物的鐵還原力與其清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基能力呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，但本研究中鐵還原力與DPPH自由基、超氧陰離子自由基能力并不相符，這個現(xiàn)象除了考慮不同自由基體系的局限性外，還因?yàn)橥跞A等人研究時采用的是簡單的有機(jī)溶劑提取法，并沒有考慮模擬消化過程中活性物質(zhì)可能發(fā)生的解離、降解、破壞等變化，因此與本研究結(jié)果并不一致。

圖6 果漿和果汁鐵離子還原力Fig.6 Ferric ion reducing antioxidant power of pulp and juice

目前對物質(zhì)抗氧化活性進(jìn)行評估的方法非常多，但結(jié)合本研究結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)不同的抗氧化活性評價方法對同一組分并不能得出完全一致的結(jié)論，這也提示我們研究抗氧化能力有必要選取不同方法進(jìn)行綜合評價。

3 結(jié)語

模擬胃液的酸性環(huán)境、模擬腸液均有利于多酚、黃酮類抗氧化物質(zhì)的釋放，增加獼猴桃對各類自由基的清除活性。胃腸消化1 h后多酚、黃酮含量最多，抗氧化能力也最強(qiáng)，但隨著消化時間的延長，部分活性物質(zhì)可能降解。由于獼猴桃活性組分的復(fù)雜多樣性以及自由基體系的不同，模擬消化產(chǎn)物的自由基清除能力的變化規(guī)律與多酚、黃酮類物質(zhì)的含量并不完全一致。此外，果漿和果汁的抗氧化能力雖有差異，但變化規(guī)律趨于一致。