沙門氏菌噬菌體ΦSHDA-1生物學(xué)特性及基因組學(xué)初步研究

溫 慧，劉 婷，陳忠軍，滿都拉，孫子羽

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018）

沙門氏菌（Salmonella）是世界上最常見的食源性致病菌之一[1]，在美國每年約有150萬例沙門氏菌感染，每10萬人中就有17.6人發(fā)病，是死亡率最高（39%）的食源性病原體[2]。2015年歐洲報(bào)告了94 625例沙門氏菌病，占?xì)W洲所有報(bào)告的食源性疾病的28%，與2014年相比增加了1.9%[3]。沙門氏菌經(jīng)常導(dǎo)致人類胃腸不適，如惡心、嘔吐和腹瀉（癥狀統(tǒng)稱為沙門氏菌?。?，如不及時治療，可能會引起危及生命的腎和肝并發(fā)癥，最終導(dǎo)致死亡[4]。沙門氏菌的污染可以發(fā)生在從農(nóng)場到消費(fèi)者的任何地方，例如生產(chǎn)、收獲、加工、儲存、運(yùn)輸、零售等[5]。已經(jīng)從世界各地的不同動物源性食品中分離出耐藥性沙門氏菌，這主要?dú)w因于抗菌劑的不當(dāng)使用，而耐藥性沙門氏菌會導(dǎo)致食源性傳染病發(fā)病率的提高[6]，因此必須開發(fā)替代方法來控制這些病原體。

噬菌體（bacteriophage，phage）是感染細(xì)菌、真菌等微生物的病毒，廣泛存在于環(huán)境和各種食物中。噬菌體具有特異性強(qiáng)、易于分離、研發(fā)成本低、對人體無害等特點(diǎn)，并且可以消除與化學(xué)抗生素相關(guān)的副作用[7-9]，所有這些特征使得噬菌體有希望成為食品中細(xì)菌病原體的新型生物控制劑。

作者從環(huán)境污水中分離獲得1株沙門氏菌裂解性噬菌體ΦSHDA-1，對其生物學(xué)特性和基因組進(jìn)行了初步研究，以期為噬菌體控制食品中沙門氏菌污染奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和樣品沙門氏菌：鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株（CMCC50115）；噬菌體ΦSHDA-1：分離自呼和浩特市某下水道污水。

1.1.2 儀器與設(shè)備恒溫振蕩培養(yǎng)箱THZ-98C：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-100SII：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；雙人單面垂直凈化工作臺SW-CJ-2FD：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀SYNERGY H1：美國伯騰儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)SIGMA 3-18KS：賽維斯科技（北京）有限公司；小型臺式高速冷凍離心機(jī)5424R：德國艾本德股份公司。

1.2 噬菌體的分離和純化

1.2.1 宿主菌株的復(fù)蘇與培養(yǎng)挑取鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，120 r/min、37℃搖床中培養(yǎng)6 h至對數(shù)生長早期，備用。

1.2.2 噬菌體的分離純化參照J(rèn)amalludeen N等[10]的方法進(jìn)行改進(jìn)，采用雙層平板法分離噬菌體。取來自內(nèi)蒙古呼和浩特市某下水道的污水，使用8層紗布粗濾，離心取上清液10 mL加入到30 mL 2×LB液體培養(yǎng)基中，并加入1 mL處于對數(shù)早期的沙門氏菌培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min、4℃離心10 min，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后即得到噬菌體原液。采用雙層平板法純化噬菌體，用SM緩沖液對噬菌體原液適當(dāng)稀釋，取適宜稀釋度各100 μL與100μL對數(shù)早期宿主菌懸液混合，加入5 mL半固體LB培養(yǎng)基，充分混勻后倒于預(yù)先制備好的LB營養(yǎng)瓊脂固體平板上，待其凝固后于37℃培養(yǎng)過夜。觀察平板上噬菌斑情況，挑取直徑大、生長均勻的單斑于SM緩沖液中，振蕩3 h后用0.22μm濾膜過濾，濾液適當(dāng)稀釋后按以上操作進(jìn)行純化，重復(fù)5次后即得到純化的噬菌體。

1.3 噬菌體的生物學(xué)特性

1.3.1 噬菌體形態(tài)觀察采用磷鎢酸負(fù)染色法，取20μL高效價（＞109PFU/mL）噬菌體液滴在銅網(wǎng)上，自然沉淀10～15 min，用濾紙從側(cè)面吸去多余的噬菌體液。再將銅網(wǎng)置于磷鎢酸染料中染色10 min，吸去多余液體，自然干燥后在透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）下觀察噬菌體形態(tài)，此試驗(yàn)由中國科學(xué)院微生物研究院進(jìn)行。

1.3.2 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of Infection，MOI）是指初始感染時噬菌體的數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值。按一定的MOI值（0.000 001、0.000 01、0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100）將噬菌體與宿主菌混合，37℃培養(yǎng)4 h，10 000 r/min離心10 min，用雙層平板法測定不同MOI值樣品中上清液的噬菌體效價[11]。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)2個平行。

1.3.3 噬菌體一步生長曲線將噬菌體與宿主菌按最佳MOI值混合，37℃溫育15 min左右，使噬菌體吸附于細(xì)菌上，于4℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清液，用等體積LB重懸，重復(fù)2次，以除去未吸附的噬菌體。加入15 mL LB液體培養(yǎng)基懸浮沉淀并充分混勻，迅速置于37℃培養(yǎng)箱于120 r/min振蕩培養(yǎng)。前45分鐘每隔5分鐘取樣，45～115 min每隔10分鐘取樣，8 000 r/min離心2 min，采用雙層平板法測定上清液中噬菌體的效價[12]。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)2個平行。

1.3.4 噬菌體熱穩(wěn)定性取已知效價的噬菌體懸液（108PFU/mL）分裝于1.5 mL無菌EP管中，將EP管分別放置在30、40、50、60、70、80℃的恒溫水浴鍋中，1 h后測定各管中噬菌體的效價[13]。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)2個平行。

1.3.5 噬菌體pH穩(wěn)定性取已知效價的噬菌體懸液（108PFU/mL）100μL加入到900μL不同pH值（1～12）的SM緩沖液中，將其置于37℃恒溫水浴鍋1 h，測定各EP管中噬菌體的效價[14]。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)2個平行。

1.3.6 噬菌體的紫外穩(wěn)定性取已知效價的噬菌體懸液（108PFU/mL，4 mL）均勻平鋪于直徑90 mm的無菌培養(yǎng)皿中，放到滅菌后的超凈工作臺上，使培養(yǎng)皿距離紫外燈（功率為14 W）2 cm，打開紫外燈后分別在0、30、60、90、120 s和5、10、30 min時取300μL噬菌體，室溫靜置至少30 min。取100μL用SM緩沖液適當(dāng)稀釋后，雙層平板法測定效價[15]。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)2個平行。

1.3.7 噬菌體對宿主菌的裂解曲線噬菌體分別按照MOI=10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01，各取100μL加入到96孔板中，并加入100μL 108CFU/mL的沙門氏菌菌液。另設(shè)空白組（Blank）加入200μL LB培養(yǎng)基；對照組（Control）加入100μL 108CFU/mL的沙門氏菌菌液和100μL LB培養(yǎng)基[16]。每隔1小時測定600 nm處的吸光值，共測定12 h。

1.4 噬菌體基因組學(xué)初步研究

1.4.1 全基因組測序噬菌體基因組DNA由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，構(gòu)建文庫類型為PE文庫。利用Illumina公司Hiseq平臺進(jìn)行2×150 bp測序。獲得的原始測序數(shù)據(jù)，經(jīng)過預(yù)處理去除接頭、引物及低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，優(yōu)化參數(shù)Kmer值，通過FastQC進(jìn)行質(zhì)量評估、通過Trimmomatic對Illumina測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量剪切，得到相對準(zhǔn)確的有效數(shù)據(jù)。使用SPAdes拼接二代測序數(shù)據(jù)，采用GapFiller對拼接得到的重疊群補(bǔ)GAP。使用Prokka預(yù)測基因元件：基因、tRNA、rRNA等，采用Repeat Masker鑒定基因組上的重復(fù)序列。利用PrInSeS-G進(jìn)行序列矯正，修正拼接過程中的剪輯錯誤及小片段的插入缺失。獲得噬菌體ΦSHDA-1最好的DNA序列拼接結(jié)果。利用TMHMM進(jìn)行跨膜蛋白預(yù)測分析，SignalP進(jìn)行信號肽預(yù)測分析，LipoP進(jìn)行脂蛋白預(yù)測分析。同時，采用CG View（http：//stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/index.html）方法繪制出噬菌體的基因組圖譜。

1.4.2 噬菌體ΦSHDA-1裂解酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析使用ProtParam在線軟件對裂解酶蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，同時使用PredictProtein（https：//www.proforprotein.org/home）預(yù)測裂解酶蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離純化

本研究是以鼠傷寒沙門氏菌為宿主菌從下水道污水中分離得到一株噬菌體，命名為ΦSHDA-1。通過雙層平板法經(jīng)過5次純化后，噬菌體ΦSHDA-1所形成的噬菌斑形態(tài)和大小保持均勻一致，呈圓形透明狀態(tài)，直徑約為3 mm，見圖1。

圖1 噬菌體ΦSHDA-1的噬菌斑形態(tài)Fig.1 Bacteriophage plaques ofΦSHDA-1

2.2 噬菌體生物學(xué)特性

2.2.1 噬菌體形態(tài)觀察噬菌體ΦSHDA-1高濃度裂解液經(jīng)過TEM觀察得到的噬菌體形態(tài)見圖2。該噬菌體具有直徑為（53±8）nm的二十面體頭部，長（112±12）nm的非收縮性尾部，符合長尾噬菌體科（Siphoviridae）特征，因此鑒定噬菌體ΦSHDA-1為長尾噬菌體。

圖2 噬菌體ΦSHDA-1的電鏡觀察圖Fig.2 TEM micrograph ofΦSHDA-1

2.2.2 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)由表1可知，噬菌體ΦSHDA-1在MOI=0.000 01時，噬菌體效價最高為6.0×1010PFU/mL，因此噬菌體ΦSHDA-1的最佳MOI為0.000 01

表1 噬菌體ΦSHDA-1的最佳感染復(fù)數(shù)的測定Table 1 Determination of optimal multiplicity of infection（MOI）

2.2.3 噬菌體一步生長曲線由圖3可知，噬菌體ΦSHDA-1在前25分鐘曲線趨勢保持平穩(wěn)，即判斷噬菌體ΦSHDA-1的潛伏期為25 min，之后噬菌體的效價急劇增加，在55 min之后逐漸保持平穩(wěn)，即判斷噬菌體爆發(fā)期為30 min。

噬菌體ΦSHDA-1的裂解量為36.52 PFU/cell。

2.2.4 噬菌體熱穩(wěn)定性由圖4可知，噬菌體在30～60℃以內(nèi)活性保持穩(wěn)定，在70℃時噬菌體ΦSHDA-1活性大約降低4個對數(shù)值，在高溫80℃時基本失活。由此可知，噬菌體ΦSHDA-1對溫度有較強(qiáng)耐受性，適合在60℃及以下環(huán)境中生存。

圖4 噬菌體的熱穩(wěn)定性Fig.4 Heat sensitivity of phageΦSHDA-1

2.2.5 噬菌體pH穩(wěn)定性由圖5可知，噬菌體ΦSHDA-1在pH值2～10范圍內(nèi)活性保持穩(wěn)定，說明該噬菌體對酸堿的耐受力較強(qiáng)；而pH低于2或者大于10時噬菌體基本失活。由此可知，噬菌體ΦSHDA-1的最適pH范圍為2～10。

圖5 噬菌體的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH sensitivity of phageΦSHDA-1

2.2.6 噬菌體的紫外穩(wěn)定性由圖6可知，噬菌體ΦSHDA-1在紫外線下照射60 s時效價降低約4個對數(shù)值，在紫外線照射120 s后完全失活，說明該噬菌體對紫外線的耐受力較弱。

圖6 噬菌體的紫外穩(wěn)定性Fig.6 UV sensitivity of phageΦSHDA-1

由圖7可知，與未加噬菌體ΦSHDA-1的陽性對照相比，噬菌體ΦSHDA-1在12 h內(nèi)不同MOI值下都可以抑制鼠傷寒沙門氏菌的生長，并且陽性對照組曲線與沙門菌正常的生長曲線相符。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，噬菌體ΦSHDA-1對宿主菌有較強(qiáng)裂解作用。

圖7 噬菌體ΦSHDA-1在不同MOI值下裂解宿主菌的曲線Fig.7 Curves of lysed host strain by the phageΦSHDA-1 in different MOI

2.3 噬菌體基因組學(xué)初步研究

2.3.1 ΦSHDA-1基因組序列分析序列組裝完成后共得到6個重疊群，長度分別為：22 458、7 543、7 224、1 430、1 086、782 bp，共40 523 bp，見表2。G+C含量為51%，編碼59個CDS，其中未發(fā)現(xiàn)tRNA和rRNA。將噬菌體ΦSHDA-1的序列在NCBI中對比，其與噬菌體Salmonella phage vB_SenS_SE1（登錄號為MK479295.1）相似度最高，覆蓋率為97%，以Salmonella phage vB_SenS_SE1噬菌體基因組序列為參考，對噬菌體ΦSHDA-1的6個重疊群進(jìn)行排序，并使用CGview server對其繪制基因組圈圖，見圖8。為了進(jìn)一步了解ΦSHDA-1與其他噬菌體的進(jìn)化關(guān)系，選取具有進(jìn)化意義且保守的噬菌體DNA聚合酶氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[17]。通過blastp比對，找到同源性高的噬菌體，在此基礎(chǔ)之上，利用進(jìn)化樹軟件MEGA-X進(jìn)行進(jìn)化分析，采用最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建的進(jìn)化樹，見圖9。由圖9可知，ΦSHDA-1與Salmonella phage vB_SenS_SE1（登錄號為MK479295.1）親緣關(guān)系相對較近。通過blastp比對結(jié)果可知，噬菌體基因編碼的保守序列具有已知的相關(guān)功能，其中包括裂解酶、終止酶、尾部相關(guān)蛋白質(zhì)等，但未發(fā)現(xiàn)穿孔素。通過對開放閱讀框與CARD以及VFDB進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)攜帶耐藥基因和毒力基因。

表2 噬菌體ΦSHDA-1基因組框架圖信息Table 2 Genome framework map ofΦSHDA-1

圖8 ΦSHDA-1基因組圈圖Fig.8 Genome map ofΦSHDA-1

圖9 ΦSHDA-1 DNA聚合酶系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree formed by DNA polymerase protein ofΦSHDA-1

2.3.2 噬菌體ΦSHDA-1裂解酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析將獲得的59個編碼基因的氨基酸序列采用blast程序逐個進(jìn)行檢索分析，發(fā)現(xiàn)一個裂解酶（LysSHDA-1）的編碼區(qū)。使用ProtParam在線軟件對LysSHDA-1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，同時使用PredictProtein預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：該蛋白質(zhì)由160個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為17 300，等電點(diǎn)為9.99，其親水性平均系數(shù)為-0.271，因此屬于親水性蛋白質(zhì)，不穩(wěn)定指數(shù)為23.52，因此屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。其二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲分別占氨基酸總數(shù)的54.38%、5.62%、40%，不包含任何核定位信號，為非球狀蛋白質(zhì)。TMHMM和SignalP的結(jié)果分析表明，其不含跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽。

3 結(jié)語

目前用于防治食品中病原菌的手段各有缺陷，且隨著抗生素長期大量和不當(dāng)使用，出現(xiàn)了越來越多的沙門氏菌耐藥株，因此迫切需要找到一種相對環(huán)保且高效的方法來控制這種病原體。噬菌體不僅能夠安全有效抑制病源微生物，而且不會對食品的外觀、營養(yǎng)及風(fēng)味造成影響。目前美國、歐洲、加拿大和澳大利亞等多個國家已將商業(yè)噬菌體制劑（例如ListShield，LMP-102，Listex P100，EcoShield和SalmoFresh）應(yīng)用于食品工業(yè)中[18]。因此噬菌體成為一種有吸引力的替代品，用于控制食品和食品加工及儲存環(huán)境中污染的沙門氏菌。

本研究以鼠傷寒沙門氏菌為宿主菌，從環(huán)境污水中分離到一株裂解性噬菌體，命名為ΦSHDA-1，其噬菌斑邊緣清晰透亮，具有典型裂解性噬菌體的特性。噬菌體ΦSHDA-1的頭部呈多面體立體對稱，頭部直徑約為（53±8）nm，尾長約（112±12）nm。根據(jù)噬菌體分類方法，本研究分離的沙門噬菌體ΦSHDA-1屬于有尾病毒目、長尾噬菌體（Siphoviridae）科。通過溫度和pH耐受實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ΦSHDA-1具有良好的酸堿穩(wěn)定性及較強(qiáng)的溫度適應(yīng)能力，且ΦSHDA-1對沙門氏菌的裂解曲線表明，其具有較好的抑菌能力，這些特征為噬菌體制劑的制備、保存及應(yīng)用提供了可靠保證。

開展噬菌體基因組學(xué)研究，不僅能夠提高我們對于噬菌體基因序列豐富多樣性程度的認(rèn)識，為進(jìn)一步了解噬菌體提供可靠的信息，還可以為噬菌體應(yīng)用或是開發(fā)新型的抗菌劑奠定科學(xué)基礎(chǔ)。噬菌體及其裂解酶作為抗生素替代品近年來備受關(guān)注，對耐藥菌的防治具有潛在的應(yīng)用價值。噬菌體裂解酶是多數(shù)噬菌體在侵染后期編碼的一類肽聚糖水解酶，其主要功能是降解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖成分，從而促使細(xì)菌裂解并釋放出子代噬菌體[19]。噬菌體裂解酶具有與細(xì)菌共同進(jìn)化的選擇優(yōu)勢和高效的裂解活性，其作用不受細(xì)菌耐藥性的影響，不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生新的抗性，而且易于人工設(shè)計(jì)和基因工程改造，因此成為噬菌體抗菌研究的關(guān)鍵基因[20]。國內(nèi)外已有很多文獻(xiàn)報(bào)道指出，裂解酶能夠被用來防控和檢測食品中的食源性致病菌[21-25]。裂解酶與其他的抑菌劑相比，它的宿主特異性較強(qiáng)，能選擇性地殺死致病菌而不會引起食品中其他天然有益菌群的改變，因此成為一種全新的抗菌劑[26]。通過blastp對比可知，ΦSHDA-1基因組含有一裂解酶基因。LysSHDA-1蛋白質(zhì)不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，同時其缺乏信號肽序列，不屬于分泌蛋白質(zhì)。上述結(jié)果表明，LysSHDA-1與大部分噬菌體的裂解酶一樣，不能夠直接穿透宿主菌的細(xì)胞膜，必須借助噬菌體編碼的穿孔素蛋白的輔助作用才能夠穿過宿主細(xì)胞膜，從而發(fā)揮其裂菌作用[27]。

在噬菌體投入到實(shí)際應(yīng)用之前必須全面深入了解其基因組信息，有研究表明，噬菌體含有編碼某些毒力因子合成的基因，在進(jìn)入宿主菌細(xì)胞之后便合成毒力因子，對人體造成危害，噬菌體還可能是耐藥菌之間耐藥基因水平傳播的介質(zhì)[28]。通過對本試驗(yàn)篩選的噬菌體的開放閱讀框與CARD以及VFDB進(jìn)行分析，噬菌體ΦSHDA-1未發(fā)現(xiàn)攜帶耐藥基因和毒力基因，保證了其作為抗菌劑用于防治食品中沙門氏菌污染的安全性?？傊?，噬菌體ΦSHDA-1的生物學(xué)特性及基因組學(xué)分析表明，其有作為抑菌劑用于防控食品中沙門氏菌污染的潛力。