基于ARTP 技術(shù)選育維生素K2優(yōu)勢菌株及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

楊自名，薛正蓮，王 洲，馮靜靜，吳 靜，李 偉，劉 艷

（安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖241000）

維生素K2（MK，VK2），又名甲萘醌，屬于脂溶性凝血類重要維生素，是由甲基萘醌母環(huán)和異戊二烯側(cè)鏈組成，可有效降低骨折發(fā)生率。據(jù)報道，日本兒童沒有普遍存在的生長痛現(xiàn)象出現(xiàn)，與他們從小吃納豆有很大關(guān)系，納豆中富含較多維生素K2，在人體內(nèi)可快速被腸道吸收，可促進骨密度增加，使骨骼更加強壯，同時也有許多文獻報道，維生素K2攝入量較多的群體能夠有效降低心臟病和心血管硬化的發(fā)病率[1-5]。另外，隨著血清維生素K缺乏誘導(dǎo)蛋白質(zhì)檢測技術(shù)的突破，越來越多的研究表明，維生素K缺乏是引發(fā)世界性嬰兒出血疾病和死亡的重要原因[6]。近幾年國內(nèi)外學(xué)者在Science和Nature等頂級國際期刊發(fā)表的研究表明，同輔酶Q相似，維生素K2作為一種膜結(jié)合電子載體，具有修復(fù)損傷細胞線粒體的功能[7-9]，這對于人類免受帕金森癥折磨起著重要的作用。由于這三方面的原因，近年來國際市場對功能性食品維生素K2的需求不斷增加。由于化學(xué)法合成維生素K2存在許多安全問題，在歐盟和部分亞洲國家被限制不能直接用于食品中。此外，微生物發(fā)酵合成維生素K2，因具有發(fā)酵原料易得、條件溫和、環(huán)境壓力小，同時因為本身來源于生物，合成的產(chǎn)品具有高生物活性和高生物相容性等優(yōu)點，成為維生素K2合成的首選方法。然而微生物發(fā)酵維生素K2得率低、生產(chǎn)成本居高不下的現(xiàn)狀仍然制約著微生物法制備維生素K2的發(fā)展。

食品級維生素K2主要是由納豆芽孢桿菌產(chǎn)生，近些年Tsukamoto Y等[10]將納豆芽孢桿菌進行紫外和亞硝基胍復(fù)合誘變后，采用結(jié)構(gòu)類似物抗性平板選育出一株維生素K2高產(chǎn)菌株，經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵后維生素K2的產(chǎn)量達到了1.719μg/g。Wu WJ等[11]從食品中分離到了一株維生素K2高產(chǎn)菌株，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化后，維生素K2產(chǎn)量達到了7.54μg/g。然而，納豆芽孢桿菌發(fā)酵制備維生素K2的產(chǎn)量尚有待提高。

ARTP誘變技術(shù)是近年來清華大學(xué)自主研發(fā)的新型誘變技術(shù)，它將高純度的氦氣作為激發(fā)氣體，大量的非平衡性等離子體流作用于微生物的遺傳物質(zhì)，破壞單核苷酸的磷酸二酯鍵，誘發(fā)細胞SOS修復(fù)機制從而導(dǎo)致遺傳物質(zhì)突變[12]。與其它誘變方法相比，常壓室溫等離子體生物誘變系統(tǒng)具有非常高的可控性，例如溫度控制力度、處理時間快速等。有報道稱從常壓室溫等離子體生物誘變系統(tǒng)釋放的等離子體種類豐富，包含紫外線、帶電粒子、活性氧、活性氮和其他活性物質(zhì)等誘變因素[13-15]。因此這些復(fù)合的誘變因素能夠更有效地提高菌體的突變率，從而更快捷的選育優(yōu)勢突變株。

采用ARTP誘變技術(shù)對作者所在實驗室從納豆粉中篩選出的納豆芽孢桿菌B-N-1進行誘變，通過結(jié)構(gòu)類似物抗性初篩、24孔板發(fā)酵復(fù)篩的方式快速選育優(yōu)勢菌株，通過響應(yīng)面設(shè)計合理的實驗方案對篩選獲得的一株維生素K2優(yōu)勢突變株納豆芽孢桿菌B-N-2進行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，對納豆芽孢桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝進行研究，為維生素K2的后續(xù)開發(fā)與利用提供參考，這對提高人們的健康水平具有十分重要的社會和經(jīng)濟意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種出發(fā)菌株由作者所在實驗室在納豆粉中篩選得到，命名為B-N-1，經(jīng)16s rRNA鑒定，該菌株屬于納豆芽孢桿菌。

1.1.2 培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉10，瓊脂20；滅菌前調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，NaCl 10，酵母粉10；滅菌前調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：大豆蛋白胨20，葡萄糖10，K2HPO40.3；滅菌前調(diào)節(jié)pH至7.0～7.3。

1.1.3 主要儀器誘變儀（ARTP-Ⅱ）：源清天幕生物科技有限公司；高效液相色譜儀（LC-2030）：島津公司；雙層振蕩恒溫培養(yǎng)箱：知楚儀器；數(shù)顯培養(yǎng)箱（250D）：金壇市杰瑞爾電器有限公司；臺式冷凍高速離心機：賽默飛世爾科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（HVE）：日本HIRAYAMA；雙人單面凈化工作臺（SW-CJ-2FD）：蘇州凈化設(shè)備有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機（DHG-9143BS-Ⅲ）：上海申安醫(yī)療器械廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司。

1.1.4 主要試劑1-羥基-2-萘甲酸（HNA）、NaCl、甘油、K2HPO4：分析純，購于國藥集團；胰蛋白胨、酵母粉、生物試劑：購于上海生工生物工程有限公司；甲醇、二氯甲烷、正己烷、異丙醇：色譜純，購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ARTP誘變將出發(fā)菌株B-N-1進行活化，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中200 r/min培養(yǎng)15 h。取1 mL菌液于4℃、5 000 r/min離心5 min，用1 mL無菌生理鹽水洗滌菌體2次，最后加入1 mL無菌生理鹽水制成菌懸液。取10μL制備好的菌懸液均勻涂在無菌小鐵片上，置于ARTP工作臺中進行誘變處理：距離2 mm、通氣量10 SLM、功率100 W，分別處理0、30、50、70、90 s。將置于990μL培養(yǎng)基中的小鐵片放在混勻振蕩器中充分混勻洗脫，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中200 r/min培養(yǎng)2 h。

1.2.2 存活率和正突變率的計算

致死率：待平板培養(yǎng)皿上長出單菌落后，對誘變平板和對照平板上的菌落進行計數(shù)，對照平板上的菌落數(shù)減去誘變平板上的菌落數(shù)和對照平板上的菌落數(shù)之比為致死率。

正突變率：分別在每個誘變處理條件下的平板上挑取單菌落進行發(fā)酵，測定每個納豆芽孢桿菌的維生素K2產(chǎn)量，測定得出維生素K2產(chǎn)量高出對照菌株10%以上為正突變株，計算其在該處理下所有菌株中所占的比例，即為正突變率。

1.2.3 突變株的篩選方法初篩采用平板篩選法，在平板培養(yǎng)基中加入一定量維生素K2的結(jié)構(gòu)抗性類似物1-羥基-2-萘甲酸（HNA）[16]，使其終質(zhì)量濃度為50 mg/L。取0.1 mL稀釋后菌液涂布于篩選平板上，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃倒置培養(yǎng)1～2 d，待長出單菌落后，挑取單菌落接入到斜面上，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)1～2 d后于4℃冰箱保存，進行下一步復(fù)篩。

復(fù)篩采用孔板發(fā)酵法。將保存在斜面上的菌種接入液體種子培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)15 h作為初始種子液。取0.5 mL種子液轉(zhuǎn)接到裝有5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)（該孔板每孔可裝12 mL培養(yǎng)基），于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。高效液相色譜檢測分析，以維生素K2產(chǎn)量的高低作為篩選依據(jù)。

1.2.4 維生素K2含量測定

1）溶液的配制 萃取液為V正己烷∶V異丙醇=2∶1，流動相為V二氯甲烷∶V甲醇=1∶9。

2）樣品中維生素K2的提取方法 參照文獻中公布的提取方法[17-19]，取2 mL混勻發(fā)酵液，10 000 r/min下離心5 min，棄上清液，加入2 mL蒸餾水反復(fù)吹打清洗，4℃、5 000 r/min下離心5 min，棄上清液，將得到的菌體加500μL萃取液，反復(fù)吹打混勻，避光靜置30 min，在4℃、12 000 r/min下離心5 min，取上層萃取液于2 mL離心管中，重復(fù)萃取步驟兩遍，加強萃取效果，最后定容至2 mL，經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾得到最終樣品。以上操作盡量避光。

3）高效液相色譜條件 色譜儀：島津液相色譜儀；色譜柱：島津5μm C18（4.6 mm×150 mm）；流動相：V甲醇∶V二氯甲烷=9∶1；流量：1.0 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：10μL；紫外檢測波長：254 nm。

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性驗證對獲得的優(yōu)勢突變株菌株B-N-2進行5次傳代實驗，測定其維生素K2產(chǎn)量，驗證菌種的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6 碳氮源、無機鹽篩選以及中心值確定保持基本培養(yǎng)基中碳氮質(zhì)量比和其它成分不變，在相同的培養(yǎng)條件下，分別以不同碳氮源和無機鹽取代基本培養(yǎng)基中的碳氮源和無機鹽，對常用的碳氮源以及無機鹽進行初步篩選，篩選過后進行梯度實驗，考察它們對B-N-2發(fā)酵產(chǎn)維生素K2的影響。

1.2.7 Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計主要考察在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加前期實驗篩選的單因素KH2PO4、甘油和酵母粉對維生素K2產(chǎn)量的影響，依據(jù)碳氮源、無機鹽篩選和中心值的確定以及相關(guān)文獻報道設(shè)置中心組合實驗，并在中心值上下游再各取一個數(shù)值作為響應(yīng)面實驗設(shè)計的因素及水平值，見表1。

表1 中心組合實驗設(shè)計的各因素和水平值Table 1 Factors and level value of central combination experiment design

采用Design-Expert軟件，根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計原理，以納豆芽孢桿菌維生素K2產(chǎn)量為評價指標，設(shè)計三因素（KH2PO4、甘油和酵母粉）三水平15次實驗，每組實驗設(shè)3個平行，維生素K2產(chǎn)量取均值，其中零點實驗重復(fù)3次，以減小誤差。最后根據(jù)得出的實驗結(jié)果，分析各因素之間的相互作用，得出最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變

2.1.1 ARTP誘變致死率以及正突變率對菌株B-N-1進行ARTP誘變處理，菌株生長情況見圖1。結(jié)果表明，隨著ARTP處理時間加長，菌株的死亡率提高，在處理80 s時致死率為91.54%。同時對每個平板上所有菌株進行發(fā)酵，測取維生素K2產(chǎn)量，維生素K2產(chǎn)量高出對照菌株10%以上為正突變株，在處理80 s時正突變率最高，見圖2。由文獻[20-24]可知，誘變時間的確定需要結(jié)合致死率與正突變率，在有一定數(shù)量菌株存活的基礎(chǔ)上正突變率大的為最佳誘變時間，因此后續(xù)實驗選擇80 s作為ARTP誘變的處理時間。

圖1 0～100 s誘變菌株菌落生長狀況Fig.1 Mutagenized strain colony growth status during 0～100 s

圖2 菌株B-N-1ARTP誘變致死曲線和正突變率曲線Fig.2 Mutant lethal curve and positive mutation rate curve of strain B-N-1 by ARTP

2.1.2 ARTP誘變處理后得到的優(yōu)勢菌株的產(chǎn)量及遺傳穩(wěn)定性將菌株B-N-1在ARTP誘變儀上誘變處理80 s，稀釋涂布于HNA平板上，設(shè)置6個平行，以保證誘變菌株的數(shù)量，37℃培養(yǎng)15 h后，在每個平板上均勻挑取15個單菌落（每個平板生長菌落數(shù)在20～30個），總計挑取80株單菌落，經(jīng)24孔板發(fā)酵后測定維生素K2產(chǎn)量。經(jīng)6輪有效ARTP誘變（有效誘變指產(chǎn)量增加的輪數(shù)）處理后（生物量和產(chǎn)量見表2），得到一株維生素K2優(yōu)勢突變株，經(jīng)高效液相色譜檢測維生素K2產(chǎn)量為13.33 mg/L，較出發(fā)菌株B-N-1提高了3.89倍，將其命名為B-N-2。與檀沐報道使用的亞硝基胍（NTG）和低能氮離子束（N+）注入復(fù)合誘變方法相比[25]，ARTP誘變選育系統(tǒng)更具有方便快捷的優(yōu)勢。標準品保留時間、B-N-1和B-N-2維生素K2產(chǎn)量見圖3。

表2 6輪有效誘變生物量及維生素K2產(chǎn)量Table 2 Six rounds of effective mutagenesis biomass and vitamin K2 yield

圖3 標準品保留時間、B-N-1高效液相色譜圖及B-N-2高效液相色譜圖Fig.3 Retention time of standard，B-N-1 HPLC and BN-2 HPLC

有文獻報道突變菌株在連續(xù)傳代過程中可能會出現(xiàn)各方面不穩(wěn)定的現(xiàn)象[26-27]。為了驗證突變菌株B-N-2的遺傳穩(wěn)定性，對該菌株進行傳代穩(wěn)定性實驗。由圖4可以看出，經(jīng)過5次傳代，B-N-2仍具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖4 突變株B-N-2的遺傳穩(wěn)定性Fig.4 Genetic stability of mutant B-N-2

2.2 碳源、氮源、無機鹽篩選以及中心值確定

由圖5可知，甘油作為碳源時維生素K2的產(chǎn)量明顯高于其他碳源，速效碳源葡萄糖效果次之，而麥芽糖、木糖、淀粉等雖然也是微生物發(fā)酵中常用碳源，但這些遲效碳源效果明顯沒有速效碳源的效果好。故選取甘油作為碳源進行下一步優(yōu)化。有機氮源中除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸外，還含有少量的糖類、脂肪、無機鹽等，所以有機氮源的作用要高于無機氮源，效果較好的有機氮源是酵母提取物，而無機氮源的效果明顯低于有機氮源，故選取酵母提取物作為氮源進行下一步培養(yǎng)基優(yōu)化。K2HPO4作用效果明顯高于其它無機鹽，故選取K2HPO4進行下一步的優(yōu)化實驗。由圖6可知，甘油、酵母粉、K2HPO4的最優(yōu)質(zhì)量濃度通過質(zhì)量濃度梯度實驗確定了范圍，將其確認為中心值，并進行響應(yīng)面法優(yōu)化，進一步縮小范圍，以確定最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

圖5 碳源、氮源及無機鹽篩選Fig.5 Carbon source screening,nitrogen source screening and inorganic salt screening

圖6 不同質(zhì)量濃度的碳源、氮源以及無機鹽對納豆芽孢桿菌產(chǎn)維生素K2產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of different concentrations of carbon sources，nitrogen sources and inorganic salts on vitamin K2 production by Bacillus natto

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化回歸模型的建立及其分析

根據(jù)圖5—6中碳氮源、無機鹽篩選和中心值確定以及文獻[26-27]報道，選取以下3種培養(yǎng)基成分并采用Design-Expert軟件的Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面回歸分析實驗，按組合進行15次發(fā)酵實驗，維生素K2產(chǎn)量測定結(jié)果見表3。

表3 中心組合實驗設(shè)計方案及響應(yīng)值Table 3 Design scheme of central combination experiment and response value

建立維生素K2發(fā)酵工藝參數(shù)的回歸模型，獲得本實驗評價指標（維生素K2產(chǎn)量）的響應(yīng)值對自變量A（KH2PO4）、B（甘油）、C（酵母粉）的二次多項式回方程：維生素K2產(chǎn)量＝21.31+0.35A+0.51B+0.28C+0.14AB-0.072AC-0.44BC-1.34A2-1.56B2-2.37C2，以維生素K2產(chǎn)量為衡量指標對該模型進行方差分析和模型系數(shù)進行顯著性差異檢驗。如表4所示，回歸模型總體在統(tǒng)計學(xué)上是呈極顯著的（p＝0.000 4＜0.01），說明該實驗?zāi)Ｐ途哂薪y(tǒng)計學(xué)意義，并且數(shù)據(jù)分析是有效的；失擬項p＝0.984 9＞0.05，不顯著，說明實驗?zāi)Ｐ蛿M合度較好，殘差可能來源于實驗過程中的隨機誤差。模型的校正系數(shù)R2＝0.955 7，說明該實驗具有較高可信度，并且誤差較小。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，3個因素的影響順序為：B（甘油）＞A（酵母粉）＞C（KH2PO4），且甘油（p＝0.008 1＜0.01）、KH2PO4（p＝0.033 9＜0.05）對維生素K2產(chǎn)量的影響顯著，酵母粉（p＝0.069 9＞0.05）對維生素K2產(chǎn)量的影響不顯著。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

根據(jù)模型擬合出的兩兩因素間相互作用的響應(yīng)面圖，進一步研究各因素間的交互作用強弱[28-31]。三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖分析表明，隨著甘油和酵母粉質(zhì)量濃度的增大，維生素K2產(chǎn)量也隨之增加。但當(dāng)質(zhì)量濃度增大到一定程度后，維生素K2產(chǎn)量有下降的趨勢，見圖7—9。且甘油、酵母粉質(zhì)量濃度交互作用響應(yīng)面圖坡度較陡，說明對維生素K2產(chǎn)量的影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。KH2PO4和甘油、KH2PO4和酵母粉交互作用響應(yīng)面圖坡度較平緩，對維生素K2產(chǎn)量的影響不顯著。

圖7 甘油和磷酸氫二鉀對維生素K2產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface map and contour map of the combined effects of glycerol and potassium dihydrogen phosphate on vitamin K2 yield

圖8 酵母粉和磷酸氫二鉀對維生素K2產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface map and contour map of the combined effects of corn steep liquor and potassium dihydrogen phosphate on vitamin K2 yield

圖9 酵母粉和甘油對維生素K2產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface map and contour map of the combined effects of yeast and glycerol on vitamin K2 yield

通過對響應(yīng)面圖和等高線圖的綜合分析，并結(jié)合Design-Expert統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)的運算處理和響應(yīng)值預(yù)測，在本實驗所考察的影響納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)量的因素和水平范圍內(nèi)，納豆芽孢桿菌發(fā)酵最優(yōu)工藝為：KH2PO40.69 g/L，甘油66.01 g/L，酵母粉25.12 g/L，在此條件下維生素K2的最大預(yù)測產(chǎn)量為20.47 mg/L。為驗證該最優(yōu)工藝參數(shù)，經(jīng)3組重復(fù)實驗，每組3個平行，維生素K2產(chǎn)量均值為20.89 mg/mL，該均值與響應(yīng)面分析實驗的預(yù)測值接近，響應(yīng)面分析法優(yōu)化出的最優(yōu)納豆芽孢桿菌發(fā)酵工藝重復(fù)性好。

3 結(jié)語

本研究表明，常壓室溫等離子體生物誘變系統(tǒng)能夠有效地誘變納豆芽孢桿菌，獲得一株維生素K2優(yōu)勢突變株B-N-2，維生素K2產(chǎn)量是誘變前的3.23倍。遺傳穩(wěn)定性試驗表明，經(jīng)誘變后獲得的維生素K2優(yōu)勢突變株B-N-2保持較高的遺傳穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的三角瓶搖瓶培養(yǎng)相比，目前微生物制藥領(lǐng)域的微孔板培養(yǎng)技術(shù)具有高度平行化、效率高、工作容積小和低消耗等優(yōu)勢[32-33]。作者使用24孔板進行復(fù)篩，這在目前的相關(guān)文獻中報道較少，該方法能夠更加快捷高效地進行誘變選育。通過Box-Behnken優(yōu)化維生素K2發(fā)酵培養(yǎng)基，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：酵母粉（25.12 g/L）、甘油（66.01 g/L）、K2HPO4（0.69 g/L）。經(jīng)實驗驗證后，維生素K2產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了56.7%。

本研究主要是基于ARTP技術(shù)選育維生素K2優(yōu)勢突變株，并對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。后續(xù)實驗將比較優(yōu)勢突變株與低產(chǎn)菌之間的基因組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組，進一步探索二者之間的差異。同時摸索優(yōu)勢突變株的最佳培養(yǎng)條件，如前體流加方式、階段控制策略等，為進一步提高維生素K2產(chǎn)量以及促進維生素K2的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支撐。