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    甜菊醇調(diào)控巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)

    2020-03-22 01:12:04楊艷宇劉婷婷
    關(guān)鍵詞:甜菊糖膽固醇調(diào)控

    李 妍,楊艷宇,劉婷婷,李 月,李 成*

    (1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連116034;2.營(yíng)口市環(huán)境監(jiān)測(cè)站,遼寧 營(yíng)口115000)

    甜菊糖作為一種天然甜味劑,是從甜葉菊中提取的一種低熱量的天然甜味劑,對(duì)高血壓、糖尿病、肥胖病等具有治療作用[1-4]。有研究表明,甜菊糖喂養(yǎng)的小鼠,其體內(nèi)膽固醇及血糖等指標(biāo)有不同程度的下降,認(rèn)為甜菊糖對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的疾病具有重要的調(diào)控作用[5-6]。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是冠心病、腦梗死、外周血管病等相關(guān)心腦血管類疾病的重要成因[7-8]。研究表明,當(dāng)血管內(nèi)的巨噬細(xì)胞不斷吞噬膽固醇后,出現(xiàn)“泡沫化”現(xiàn)象,形成泡沫細(xì)胞,泡沫細(xì)胞滲透到動(dòng)脈壁后,細(xì)胞內(nèi)膽固醇釋放,促進(jìn)AS的病程發(fā)展[9]。介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的主要蛋白質(zhì)是ABCA1蛋白,它能夠有效介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇的外流,對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用[10-12]。因此,尋找能夠提高ABCA1蛋白表達(dá)的小分子藥物前體,對(duì)AS的預(yù)防及治療都具有非常重要的意義。

    研究表明,甜菊糖在機(jī)體消化道的下段會(huì)被盲腸內(nèi)微生物分解為甜菊醇[3]。因此,研究人員認(rèn)為,甜菊糖被食用后,甜菊醇是其進(jìn)入機(jī)體并參與代謝系統(tǒng)的主要化學(xué)成分。據(jù)此推測(cè),甜菊醇作為甜菊糖的衍生物,是調(diào)控機(jī)體膽固醇代謝的主要物質(zhì)[13],但其使用條件尚不明確。作者以小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1為模型,檢測(cè)了甜菊醇對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)重要蛋白ABCA1表達(dá)的影響,初步探討了甜菊醇調(diào)控ABCA1的作用機(jī)制,為后續(xù)治療和預(yù)防AS奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 材料小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A.1:上海富衡生物有限公司。

    1.1.2 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、25%胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素:Gibco公司;CPT和STE:Sigma公司;NP-40裂解液、蛋白酶抑制劑、PMSF、DAPI染色液、Alexa Fluor 555熒光二抗、抗熒光猝滅劑、山羊血清工作液、ECL顯影液:上海碧云天公司;qRT-PCR試劑盒、RNA提取試劑盒:北京天根有限公司;兔抗鼠PPAR-α一抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、兔抗鼠β-actin一抗、兔抗鼠ABCA1一抗、兔抗鼠LXRα一抗:北京全式金公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.1.3 儀器MultiskanGo酶標(biāo)儀:Thermo Scientific(中國(guó))公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱:三洋電機(jī)株式會(huì)社;倒置熒光顯微鏡:奧林巴斯(中國(guó))有限公司;LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR:羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;Tanon-5200Multi凝膠成像儀:上海天能科技有限公司。

    1.1.4 引物利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄內(nèi)參引物qT-GADPH、qT-ABCA1、qT-LXRα、qTPPARγ、qT-PPARα的熒光定量PCR引物,特異性引物序列見表1。

    表1 各個(gè)基因的引物序列Table 1 Sequence of different primers

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A.1在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(100 U/mL的青霉素和100 U/mL的鏈霉素)中進(jìn)行培養(yǎng),置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2,飽和濕度為100%的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng),每48小時(shí)換一次液,細(xì)胞密度達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行一次傳代,使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

    1.2.2 CPT處理小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1設(shè)置了6個(gè)CPT濃度梯度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/L),與小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1細(xì)胞共同孵育24 h,以DMEM培養(yǎng)基處理的細(xì)胞作對(duì)照組,利用MTT[14]檢測(cè)CPT對(duì)細(xì)胞活性的影響。

    1.2.3 STE處理小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1確定了CPT的添加濃度后,不同濃度的STE(5、10、25、50、75、100、125μmol/L)處理24 h后,MTT法分析其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞(J774A.1)活性的影響。

    1.2.4 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈4℃、3 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞。采用天根微量樣品總RNA提取試劑盒提取各個(gè)處理組細(xì)胞樣品的總RNA[15]。瓊脂糖電泳鑒定后,參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說(shuō)明,以細(xì)胞總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。

    1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)情況以各組的cDNA為模板,利用熒光定量PCR法檢測(cè)ABCA1、LXRα、PPARγ和PPARα的表達(dá)情況,內(nèi)參基因?yàn)镚ADPH。其中,反應(yīng)條件95℃,20 s;Tm根據(jù)各組引物的退火溫度確定;56℃,20 s;72℃,20 s;40個(gè)循環(huán),采用2-△△CT法計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量[16]。

    1.2.6 提取細(xì)胞全蛋白質(zhì)每組細(xì)胞樣品加入80 μL裂解液(2%NP40中加入蛋白酶抑制劑、EDTA、3μL 100 mmol/L PMSF),冰上重懸細(xì)胞,靜置30 min。13 000 r/min離心收集上清液。采用凱基BCA蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒(BCA法),對(duì)獲得的全蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

    1.2.7 免疫蛋白印記檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況取各組樣品的全蛋白質(zhì)提取物,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)至PVDF膜后,進(jìn)行免疫蛋白印記(Western-Blot)檢測(cè)ABCA1、LXRα和PPARα的表達(dá)情況。凝膠成像儀分析免疫印跡條帶的相對(duì)灰度值,以反映各個(gè)蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量,每組相對(duì)灰度值的計(jì)算以β-actin蛋白作為內(nèi)參。

    1.2.8 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況各組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次后加入0.1%Triton X-100處理10 min,加入山羊血清工作液(5%),濕盒內(nèi)室溫封閉2 h后加入稀釋好的一抗(1∶200兔抗小鼠,3%山羊血清工作液),4℃過夜孵育。加入稀釋好的Alexa Fluor 555熒光二抗(1∶2 500)后,室溫、避光孵育1 h。DAPI(每孔10μL)復(fù)染細(xì)胞核15 min后,滴加抗熒光猝滅劑,各組樣品置于熒光顯微鏡下觀察。

    1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理[17]。兩組間數(shù)據(jù)比較采用單因素T檢驗(yàn),多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以p<0.05(*)表示數(shù)據(jù)間差異顯著,p<0.01(**)表示數(shù)據(jù)間差異極顯著。數(shù)據(jù)中的誤差線表示至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單獨(dú)的STE不能調(diào)控J774A.1細(xì)胞ABCA1的表達(dá)

    檢測(cè)了STE對(duì)J774A.1細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。首先檢測(cè)了STE對(duì)細(xì)胞的毒性作用。MTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在較大的濃度范圍內(nèi)(0~100 μmol/L),STE對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞幾乎無(wú)毒性;125 μmol/L的STE作用于巨噬細(xì)胞時(shí),J774.1細(xì)胞出現(xiàn)了一定程度的死亡,存活率為87.1%(p<0.05),見圖1(a)。選取適中濃度的STE(50μmol/L)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖1(b)。和對(duì)照組比較,50μmol/L STE處理的細(xì)胞的ABCA1的表達(dá)量沒有出現(xiàn)明顯的變化。這表明,單獨(dú)的STE不會(huì)影響小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1上ABCA1的表達(dá)。

    圖1 STE對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞(J774A.1)活性的影響以及STE對(duì)ABCA1蛋白表達(dá)的調(diào)控Fig.1 Effects of STE on the activity of mouse macrophages J774A.1 and the function of STE on the expression of ABCA1

    2.2 確定STE/CPT的使用濃度

    因?yàn)樘鹁沾伎梢越档托∈竽c道細(xì)胞的ATP含量[6],從而影響第二信使cAMP,而ABCA1的表達(dá)會(huì)受cAMP含量的影響?;谏鲜鲈?,在使用STE的同時(shí),將加入cAMP類似物CPT[18]來(lái)調(diào)控胞內(nèi)的cAMP水平。利用MTT法首先確定了CPT可使用濃度,結(jié)果見圖2(a)。在較低的CPT濃度范圍時(shí)(≤0.8μmol/L),CPT的添加未對(duì)細(xì)胞造成任何損傷和毒性。當(dāng)CPT濃度升至1.0μmol/L時(shí),J774A.1細(xì)胞出現(xiàn)了一定程度的損傷?;贛TT結(jié)果,確定0.2~0.8μmol/L的CPT濃度均可用于后續(xù)研究,作者選擇0.4μmol/L的CPT與STE共同處理細(xì)胞。

    圖2 CPT和CPT/STE對(duì)J774A.1細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effects of CPT and CPT/STE on the activity of J774A.1

    在添加CPT的基礎(chǔ)上,引入不同濃度(0、5、10、25、50、75、100、125μmol/L)的STE。由于CPT和STE的共同引入,對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1的活性均有一定的毒副作用。當(dāng)STE為5~50μmol/L時(shí),細(xì)胞的活性>90%;隨著STE濃度的增加(75~125 μmol/L),細(xì)胞的活性降至對(duì)照細(xì)胞活性的70%左右,見圖2(b)。選取50μmol/L STE和0.4μmol/L CPT共同處理細(xì)胞,研究其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)的作用。

    2.3 STE/CPT上調(diào)J774A.1細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)

    設(shè)置了4個(gè)實(shí)驗(yàn)組,Western blot檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)ABCA1的表達(dá)情況,結(jié)果見圖3。與對(duì)照組相比,單獨(dú)STE不能影響ABCA1的表達(dá)。CPT處理后,ABCA1的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào),灰度值約是對(duì)照組的2.8倍(p<0.05)。STE/CPT處理組細(xì)胞內(nèi)ABCA1的表達(dá)大幅上調(diào),灰度值約是對(duì)照組的20倍(p<0.01)。免疫印跡結(jié)果初步表明,在CPT的基礎(chǔ)上,STE可以顯著上調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)ABCA1在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。

    圖3 Western blot檢測(cè)ABCA1蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of ABCA1 protein detected by western blot

    進(jìn)一步利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)在細(xì)胞水平直接檢測(cè)ABCA1的蛋白質(zhì)表達(dá)情況,結(jié)果見圖4。其中,藍(lán)色熒光為DAPI染色后的細(xì)胞核,紅色熒光為Alexa Fluor 555二抗特異識(shí)別的ABCA1蛋白。結(jié)果表明,對(duì)照組細(xì)胞和單獨(dú)STE處理的細(xì)胞內(nèi),ABCA1的表達(dá)量相對(duì)較低,視野內(nèi)沒有出現(xiàn)明顯的紅色熒光;CPT處理后,細(xì)胞內(nèi)依稀可見紅色熒光,但強(qiáng)度較弱;當(dāng)用STE/CPT處理時(shí),胞內(nèi)紅色熒光的強(qiáng)度明顯增加,見圖4。細(xì)胞免疫熒光的結(jié)果與Western Blot幾乎一致,即單獨(dú)的STE對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1上ABCA1的表達(dá)沒有明顯的調(diào)控作用,但是在CPT的基礎(chǔ)上,STE的添加可以顯著增加ABCA1在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。

    圖4 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞(J774A.1)上ABCA1蛋白的表達(dá)情況Fig.4 Expression of ABCA1 protein in J774A.1 cells detected by immunofluorescence

    熒光定量PCR進(jìn)一步檢測(cè)STE對(duì)ABCA1蛋白在mRNA水平的調(diào)控作用,結(jié)果見圖5。相較于對(duì)照組,單獨(dú)STE處理時(shí),細(xì)胞ABCA1的mRNA水平?jīng)]有明顯變化;單獨(dú)的CPT處理時(shí),細(xì)胞內(nèi)ABCA1的表達(dá)量出現(xiàn)了明顯上調(diào),約是對(duì)照組的19.4倍左右(p<0.05);但是,當(dāng)細(xì)胞以STE/CPT共同處理時(shí),相較于其它組別,ABCA1的mRNA水平大幅度上調(diào),是對(duì)照組的36.9倍左右(p<0.01)。這表明在CPT的基礎(chǔ)上,STE也能提高小鼠巨噬細(xì)胞ABCA1在mRNA水平上的表達(dá)。

    圖5 熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞(J774A.1)中ABCA1蛋白的mRNA表達(dá)情況Fig.5 Expression of ABCA1 mRNA detected by QRTPCR

    結(jié)果表明,單獨(dú)STE不能調(diào)控ABCA1的表達(dá),可能是細(xì)胞內(nèi)ATP轉(zhuǎn)化被抑制,降低了cAMP的濃度,從而影響了細(xì)胞信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程;而CPT的添加可以抵消STE對(duì)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化途徑的負(fù)作用。同時(shí),在CPT的基礎(chǔ)上,STE能顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞(J774A.1)ABCA1蛋白在蛋白質(zhì)及mRNA水平上的表達(dá)。

    2.4 STE調(diào)控ABCA1表達(dá)機(jī)制的初步探討

    ABCA1在體內(nèi)受多種因素調(diào)節(jié),研究發(fā)現(xiàn),LXRα和PPAR家族受體被認(rèn)為是調(diào)控ABCA1基因表達(dá)的主要核受體[19]。LXRα主要是通過和視黃醇類X受體RXR組成的異源二聚體LXR/RXR來(lái)識(shí)別ABCA1基因啟動(dòng)子上的DR-4元件,進(jìn)而啟動(dòng)ABCA1的表達(dá)[20]。PPAR家族受體不能直接調(diào)控ABCA1基因啟動(dòng)子的表達(dá),而是通過LXRα進(jìn)行間接調(diào)控,因此PPAR→LXRα是研究較多的ABCA1調(diào)控通路。

    Western Blot和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),STE/CPT均能上調(diào)LXRα在蛋白質(zhì)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),結(jié)果見圖6。在蛋白質(zhì)水平上,單獨(dú)STE處理后細(xì)胞內(nèi)LXRα沒有出現(xiàn)明顯變化;CPT可以提高LXRα蛋白的表達(dá)量約3倍(p<0.01);當(dāng)STE/CPT共同作用后,LXRα的表達(dá)量是對(duì)照組的4倍左右(p<0.01),見圖6(a)。在mRNA水平上,相比于對(duì)照組和STE處理組,CPT處理時(shí),LXRα的mRNA水平約是對(duì)照組的3.6倍(p<0.05);STE/CPT共同處理時(shí),LXRα的mRNA水平顯著提高,約是對(duì)照組的5.2倍(p<0.01),見圖6(b)。這表明STE/CPT能在mRNA和蛋白質(zhì)水平上顯著提高ABCA1上游調(diào)控因子LXRα的表達(dá)。

    圖6 STE/CPT共同作用對(duì)LXRα蛋白和mRNA表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of STE/CPT on the expression of LXRα protein and mRNA

    研究發(fā)現(xiàn),PPARs家族受體能夠調(diào)控膽固醇的有兩個(gè)成員,PPARα和PPARγ,LXRα是二者下游的靶基因[21]。熒光定量檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),STE/CPT共同處理24 h后,PPARγ的mRNA表達(dá)沒有出現(xiàn)變化,即STE/CPT不能調(diào)控PPARγ的表達(dá)水平,見圖7。

    圖7 STE/CPT共同作用對(duì)PPARγmRNA表達(dá)的影響Fig.7 Effect of STE/CPT interaction on PPARγmRNA expression

    進(jìn)一步分析了STE/CPT對(duì)PPARα表達(dá)的影響,結(jié)果見圖8。相較于對(duì)照組,單獨(dú)CPT處理時(shí),細(xì)胞內(nèi)PPARα的表達(dá)量出現(xiàn)了明顯上調(diào),是對(duì)照組的4倍左右(p<0.05);當(dāng)細(xì)胞以STE/CPT共同處理時(shí),單獨(dú)的STE和單獨(dú)CPT處理組中,PPARα的mRNA水平顯著上調(diào),約是對(duì)照組的5.13倍(p<0.05),見圖8(a)。因此,STE/CPT共同處理后,可以在轉(zhuǎn)錄水平上顯著提高調(diào)控因子PPARα的表達(dá)水平。Western Blot結(jié)果表明,單獨(dú)的STE處理不影響PPARα蛋白的表達(dá)量,單獨(dú)CPT處理使PPARα蛋白的表達(dá)量提高了2倍多。STE/CPT共同作用后,PPARα蛋白表達(dá)量約是對(duì)照組的3.4倍(p<0.01),見圖8(b)。這表明,STE/CPT可以顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1 PPARα在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。

    圖8 STE/CPT共同作用對(duì)PPARαmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響Fig.8 Effects of STE/CPT on the expression of PPARα mRNA and protein

    綜上所述,初步推測(cè)STE/CPT能上調(diào)ABCA1的表達(dá)可能是通過PPARα-LXRα-ABCA1的通路途徑。

    3 結(jié)語(yǔ)

    膽固醇是細(xì)胞膜的重要組成部分,在機(jī)體的信息傳遞、膽汁酸合成以及激素合成中扮演著重要的角色。目前心腦血管類疾病的發(fā)病率一直居高不下,然而過多的膽固醇會(huì)引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化性疾病。機(jī)體對(duì)膽固醇分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜,其中膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)是機(jī)體膽固醇代謝的重要途徑,也是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。ABCA1在膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中具有重要作用,如果能夠根據(jù)機(jī)體脂肪代謝的需要,有效地調(diào)節(jié)ABCA1的表達(dá)水平,對(duì)機(jī)體的脂代謝和AS的治療具有重要意義。

    甜菊糖,又稱甜菊糖、甜菊糖苷,是從植物甜葉菊中提取的新型天然甜味劑。國(guó)外早有使用甜葉菊作為藥草和代糖的歷史。我國(guó)是甜菊糖的主要生產(chǎn)國(guó)。目前,甜菊糖已在世界各地廣泛應(yīng)用于食品、飲料、調(diào)味料的生產(chǎn)。甜菊糖的熱量極低,攝入人體后不被吸收,也是糖尿病和肥胖病患者適用的甜味劑。研究表明,甜菊糖兼具有藥理活性,能夠預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、高血糖、高血壓等疾病,還可以作為免疫增強(qiáng)劑使用[22-24]。研究發(fā)現(xiàn),甜菊糖會(huì)被腸道內(nèi)的微生物降解為甜菊醇,部分甜菊醇會(huì)被腸道吸收,經(jīng)由肝臟,然后通過血液,最后從腎臟排出體內(nèi)[25]。據(jù)此推測(cè)甜菊糖的許多生理功與甜菊醇具有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),STE可以有效地調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞ABCA1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,這一結(jié)果給AS相關(guān)疾病藥物的開發(fā)提供了相關(guān)的理論依據(jù)。

    由于甜菊醇可以降低小鼠腸道細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收,從而降低腸道細(xì)胞內(nèi)的ATP含量;另外,甜菊醇對(duì)細(xì)胞的呼吸鏈也有明顯的抑制作用,從而使胞內(nèi)ATP的生成和轉(zhuǎn)化出現(xiàn)抑制,降低了其ATP含量[6,26-28]。我們知道,細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使cAMP來(lái)源于ATP的轉(zhuǎn)化,當(dāng)胞內(nèi)ATP下降時(shí)必然會(huì)導(dǎo)致cAMP的轉(zhuǎn)化受阻,而ABCA1的表達(dá)與胞內(nèi)cAMP的水平密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)cAMP及其類似物會(huì)調(diào)控巨噬細(xì)胞RAW264的質(zhì)膜蛋白ABCA1的表達(dá)[29]?;谏鲜鲈?,我們推斷,甜菊醇的加入應(yīng)該通過抑制ATP的形成,從而影響了胞內(nèi)cAMP的生成,使ABCA1的表達(dá)受到抑制。本研究也證實(shí)了單獨(dú)的CPT同樣也可以顯著上調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞ABCA1的表達(dá)水平?;谏鲜鲈?,在使用STE的同時(shí),加入cAMP類似物CPT來(lái)調(diào)控胞內(nèi)cAMP水平。STE必須在添加了cAMP類似物CPT的基礎(chǔ)上,才能顯著提高巨噬細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1的表達(dá)水平。

    ABCA1在體內(nèi)受多種因素調(diào)節(jié),包括上調(diào)ABCA1基因表達(dá)的LXR家族受體、PPAR家族受體和炎癥因子TGF-β,以及下調(diào)ABCA1基因表達(dá)的TNF-α、IL-1β和TNFγ等,其中LXR家族受體被認(rèn)為是調(diào)控ABCA1基因表達(dá)的主要核受體[19]。研究發(fā)現(xiàn),STE/CPT能夠上調(diào)機(jī)體重要的核轉(zhuǎn)錄受體LXRα蛋白的表達(dá)。PPAR家族受體也是研究較多的調(diào)控因子,近期有研究發(fā)現(xiàn),仙人掌多糖能夠通過PPARγ→LXRα途徑調(diào)控ABCA1的表達(dá)[30]。我們前期也檢測(cè)了STE對(duì)PPARγ受體表達(dá)的影響,但是結(jié)果發(fā)現(xiàn),STE不能調(diào)控PPARγ的表達(dá)。因?yàn)镻PAR是一個(gè)成員眾多的受體家族,PPARs家族受體PPARα也能參與機(jī)體的膽固醇的調(diào)控。進(jìn)一步結(jié)果表明,STE能夠上調(diào)機(jī)體重要的核轉(zhuǎn)錄受體PPARα在蛋白質(zhì)水平和mRNA水平的表達(dá)?;谏鲜鼋Y(jié)果,我們初步推測(cè),STE/CPT能夠上調(diào)ABCA1的表達(dá)可能是通過PPARα-LXRα-ABCA1的通路途徑。

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