EMA結(jié)合實時熒光PCR方法檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌

吳海江，孫玉萍，范田麗，趙建勇，張煌濤，張曉波，楊珊珊

（1.新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院/國家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830054）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一種食源性致病菌，可在冰箱冷藏室生長繁殖[1-2]。人感染后引起腦膜炎、流產(chǎn)、敗血癥等疾病，致死率達(dá)20%～30%，美國每年近300人死亡[3]。我國非常重視L.monocytogenes污染，要求預(yù)包裝食品檢出率為零，因此準(zhǔn)確快速檢測成為研究熱點[4-5]。

目前，L.monocytogenes檢測方法有生理生化[6]、酶聯(lián)免疫方法[7]等，操作繁雜、試劑成本高，確定陽性樣品需要5～8 d[8]。實時熒光PCR檢測具有高效準(zhǔn)確、操作簡單、減少交叉污染等優(yōu)點[9]。利用核酸熒光染料疊氮溴化乙錠（EMA）與死菌DNA共價結(jié)合阻斷PCR反應(yīng)[10-11]，通過qPCR循環(huán)次數(shù)（Ct值）增加區(qū)分死菌。Casini等[12]監(jiān)測醫(yī)院直飲水中軍團(tuán)菌（Legionella）。有研究表明，脫氧膽酸鈉溶液（SD）處理受損細(xì)胞，增強EMA滲入。Wang等[13]用0.1%SD處理腸出血性大腸埃希氏菌O157，抑制效果增強。

TaqMan熒光水解探針特異性強、高通量[14-15]。hly基因編碼李斯特溶血素O（LLO）是L.monocytogenes重要的致病物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)菌在巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞中傳播[16]。作者設(shè)計引物、TaqMan探針檢測hly基因，將EMA與qPCR結(jié)合鑒別活菌，嘗試SD強化抑制效果，人工污染樣品測試實用性。本方法操作簡單、準(zhǔn)確可靠，為食品、環(huán)境中檢測L.monocytogenes提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種

56株標(biāo)準(zhǔn)菌株：購自美國種質(zhì)保藏中心（ATCC）、英國典型菌種保藏中心（NCTC）、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC），分離株由國家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（新疆）分離保存。

1.2 主要試劑和儀器

EMA：購自美國Sigma公司；細(xì)菌DNA提取試劑：購自上海生工公司；qPCR反應(yīng)試劑Premix Ex Taq（含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+等）：購自日本Takara寶生物公司；SD：購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；微生物培養(yǎng)基：購自北京陸橋有限公司。

Dry Block Heater 2金屬干浴器：德國IKA公司；ROTINA 420離心機(jī)：德國Hettich公司；VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀：法國生物梅里埃公司；LED光照裝置（等效于鹵素?zé)?00 W）：日本Takara寶生物公司；CFX96熒光定量PCR儀：美國伯樂Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物的培養(yǎng)將L.monocytogenes、沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌（O-157:H7）等標(biāo)準(zhǔn)菌株、實驗室分離株用腦心浸出液肉湯（BHI）復(fù)蘇，VITEK 2 Compact確認(rèn)。將單菌落接種于10 mL緩沖蛋白胨水（Buffered peptone water，BPW）試管中，36℃過夜培養(yǎng)至對數(shù)期。

1.3.2 熱致死方法取培養(yǎng)至對數(shù)期L.monocytogenes的新鮮菌液，調(diào)整菌懸液為0.5麥?zhǔn)蠞岫龋s1.5×108CFU/mL），取1 000μL至1.5 mL離心管中，金屬干浴80℃加熱10 min，冷卻至室溫。活菌置于冰盒中避免繁殖擴(kuò)增。吸取菌液300、300、400μL，涂布于顯色培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)48 h觀察生長情況，計算菌落數(shù)量。

1.3.3 最適EMA質(zhì)量濃度及DNA提取將EMA溶解制成質(zhì)量濃度2.5 mg/mL母液，-20℃避光保存。將EMA加入菌液，用渦旋振蕩器混勻，每管終質(zhì)量濃度為0、2.5、5.0、7.5、10.0μg/mL。暗處避光、室溫靜置15 min，過程中每隔2～3 min用手輕彈混勻。暗反應(yīng)后，用LED裝置光照15 min（或500 W鹵素?zé)簦嚯x20 cm，光照15 min）。細(xì)菌DNA通過上海生工試劑提取，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 qPCR引物探針設(shè)計以L.monocytogenes溶血蛋白基因hly（Genbank accession no.M24199）為目的基因，使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物、TaqMan探針，美國Thermo Fisher賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成。

qPCR反應(yīng)體系（25μL）：12.5μL Premix Ex Taq；10μmol/L上、下游引物、探針各0.5μL；DNA模板2.0μL；用ddH2O補至25μL。反應(yīng)程序：95℃30 s、95℃5 s、60℃30 s（收集FAM熒光），40個循環(huán)。通過Bio-rad伯樂CFX Manager Software軟件分析實驗數(shù)據(jù)。

表1 引物探針序列Table 1 Sequences of primers and probe

1.3.5 EMA-qPCR方法檢出限將0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊腖.monocytogenes活菌（約1.5×108CFU/mL）進(jìn)行10倍梯度稀釋，制得濃度為106、105、104、103、102CFU/mL菌液，EMA處理和未處理菌液同時進(jìn)行qPCR檢測，確定方法檢出限。

1.3.6 SD增強EMA-qPCR效果將體積分?jǐn)?shù)1%SD分別加入熱致死、活L.monocytogenes培養(yǎng)液中，使SD終體積分?jǐn)?shù)為0.01%、0.03%、0.1%。充分混勻后，暗處避光、室溫靜置20 min，過程中每隔6～7 min用手輕彈混勻后，后續(xù)按1.3.3處理，選擇最適質(zhì)量濃度EMA處理進(jìn)行qPCR檢測。

1.3.7 人工污染樣品檢測從超市、商場、垃圾處理站采集食品、環(huán)境樣品73份，包括鹵雞肉、牛奶、肉餡、垃圾滲濾液。經(jīng)高溫滅菌后，25 g樣品分別加入L.monocytogenes死菌、活菌，增菌液至0.3～0.5麥?zhǔn)蠞岫葧r，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.30-2016[17]定性法和EMA-qPCR方法檢測L.monocytogenes。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗原理

EMA進(jìn)入熱致死L.monocytogenes細(xì)胞經(jīng)可見光曝光，所帶的光敏性基團(tuán)（-N3）脫去（-N2）轉(zhuǎn)化為高活性的氮賓中間體，與DNA鏈上碳?xì)浠衔锝Y(jié)合形成不可逆的共價鍵（-NH-CH2-），造成DNA永久修飾抑制PCR反應(yīng)[18]。EMA處理死菌Ct值增加，實現(xiàn)消除“假陽性”特異性檢測活菌，見圖1。

圖1 檢測單增李斯特氏菌活菌示意圖Fig.1 Overall process of EMA-qPCR assay for detection of live Listeria monocytogenes

前增菌采用非選擇BPW培養(yǎng)基，適用于L.monocytogenes、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、空腸彎曲菌等食品致病菌在食品加工熱處理及防腐劑添加過程中的損傷恢復(fù)和增菌培養(yǎng)。本研究方法可同時檢測多種致病菌，細(xì)菌DNA提取全過程在一個離心管中完成，裂解液直接qPCR檢測，操作簡單，防止交叉污染。

2.2 qPCR檢測特異性

實驗重要因素是引物、TaqMan探針對編碼李斯特溶血素O（LLO）基因hly靈敏性和特異性。通過檢測56株常見的致病菌，包括L.monocytogenes、李斯特菌屬、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157、蠟樣芽胞桿菌等，結(jié)果僅有L.monocytogenes準(zhǔn)確擴(kuò)增檢測，其他菌株的Ct值均大于35或無Ct值（無信號），無交叉反應(yīng)，表明方法有高度特異性，見表2。

表2 驗證qPCR方法檢測L.monocytogenes特異性菌株Table 2 Strains used for validation in qPCR assay for identification of Listeria monocytogenes

2.3 最適EMA質(zhì)量濃度

隨著EMA質(zhì)量濃度的增大，熱致死L.monocytogenes的Ct值升增加。當(dāng)EMA質(zhì)量濃度為2.5μg/mL時，有效抑制熱致死菌DNA擴(kuò)增，EMA無法進(jìn)入活菌細(xì)胞內(nèi)，Ct值增幅可以忽略，與未處理的熱致死菌相比，Ct值相差6。EMA質(zhì)量濃度大于5.0μg/mL，死菌Ct值增幅不明顯，影響效果接近飽和；EMA進(jìn)入活菌影響結(jié)果，活菌Ct值增加。選取最適質(zhì)量濃度為2.5μg/mL，經(jīng)過EMA處理樣品菌液qPCR結(jié)果增加5以上，判定含有L.monocytogenes死菌，見圖2—3。

圖2 不同質(zhì)量濃度EMA對活及熱致死L.monocytogenes影響Fig.2 Effect of different EMA concentrations on qPCR signals of live and heat-killed Listeria monocytogenes

圖3 比較EMA質(zhì)量濃度為2.5μg/mL對活及熱致死L.monocytogenes的qPCR擴(kuò)增Fig.3 Comparison of DNA amplification of live and heat-killed Listeria monocytogenes treated with 2.5μg/mL EMA in the qPCR assay

2.4 檢出限

將0.5麥?zhǔn)蠞岫萀.monocytogenes（約1.5×108CFU/mL）活菌10倍梯度稀釋，用質(zhì)量濃度2.5μg/mL EMA處理菌液，與未處理菌液進(jìn)行qPCR實驗。結(jié)果顯示，EMA處理與未處理qPCR結(jié)果近似，低質(zhì)量濃度EMA影響較小，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.991。菌液濃度為150 CFU/mL時，實驗結(jié)果Ct值為34.7。EMAqPCR方法檢測L.monocytogenes的檢出限為150 CFU/mL，見圖4。

圖4 L.monocytogenes活菌10倍梯度稀釋2.5μg/mL EMA處理和未處理qPCR檢測結(jié)果Fig.4 A serial of 10-fold-diluted live Listeria monocytogenes cell dilutions were treated with EMA or without EMA

2.5 SD增強EMA-qPCR效果

當(dāng)SD體積分?jǐn)?shù)由0.01%增至0.1%，EMAqPCR檢測結(jié)果顯示，L.monocytogenes活菌Ct值增加。SD體積分?jǐn)?shù)為0.1%時，活菌Ct值為31。分析原因，L.monocytogenes屬于革蘭氏陽性菌，對膽鹽敏感，膽鹽通常作為分離革蘭氏陰性菌抑制劑，如沙門氏菌、腸出血性埃希氏菌分離培養(yǎng)時使用[19]。高體積分?jǐn)?shù)SD導(dǎo)致活L.monocytogenes細(xì)胞膜受損，EMA進(jìn)入菌體，影響qPCR檢測。結(jié)果說明SD不適合L.monocytogenes作為EMA-qPCR方法的前處理，見圖5。

圖5 不同體積分?jǐn)?shù)SD處理對L.monocytogenes活菌、熱致死菌EMA-qPCR檢測影響Fig.5 Effect of exposure of live and heat-killed Listeria monocytogenes to EMA in the presence of different concentrations of sodium deoxycholate(SD)

2.6 人工污染樣品

人工污染樣品包括18份鹵雞肉、19份牛奶、29份肉餡和8份垃圾滲濾液，共計73份。陰性樣本加入熱致死L.monocytogenes，EMA-qPCR方法快速鑒別與傳統(tǒng)培養(yǎng)法一致，共計42份陽性樣本，30份陰性樣本，結(jié)果準(zhǔn)確率100%，表明本方法良好的實用性和可靠性，見表3。

表3 EMA-qPCR方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測人工污染L.monocytogenes樣品結(jié)果Table 3 Result of EMA-qPCR method compared to the traditional culture method for identification of Listeria monocytogenes in artificial contaminated samples

3 結(jié)語

近年來，國家市場監(jiān)督管理總局組織食品監(jiān)督安全抽檢顯示，微生物污染問題占比較大，許多產(chǎn)品不合格由微生物造成，餐飲領(lǐng)域、環(huán)境污水檢測致病菌都缺少高效方法。因此，建立快速準(zhǔn)確的檢測方法對食品安全和環(huán)境保護(hù)有重要意義。王靜等[20]應(yīng)用PMA-ddPCR方法檢測食品中106 CFU/mL滅活沙門氏菌。本研究可直接用qPCR方法檢測L.monocytogenes，也可以結(jié)合EMA處理檢測L.monocytogenes活菌，打消PCR方法無法檢測活菌的疑慮。與傳統(tǒng)培養(yǎng)法5～8 d相比，EMA-qPCR檢測方法24 h完成（包括前增菌、DNA提取、EMA處理和qPCR實驗），期待可成為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，未來應(yīng)用于批量檢測樣品的自動化儀器。