超聲振蕩改性玉米醇溶蛋白及高F值寡肽制備

李婷婷，田亞平*，周楠迪，孫付保，王志翠

（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.紐綏笙特殊醫(yī)用食品江蘇有限公司，江蘇泰州225300）

玉米醇溶蛋白（Zein），其含量位居玉米蛋白首位，約占比60%[1]；其具有成膜、黏結(jié)、生物降解和抗氧化等特性，被用于制作保鮮、藥物緩沖、活性包裝等材料[2]，但以其為原料酶法制備活性肽就需要解決其易形成“粘彈性面筋團(tuán)”的現(xiàn)象[3]；其富含異亮氨酸、亮氨酸，缺乏色氨酸，是用于生產(chǎn)高F值寡肽的優(yōu)質(zhì)天然蛋白質(zhì)[4]。

高F值寡肽，其為一類(lèi)混合物，相對(duì)分子質(zhì)量為200～1 000；其組成獨(dú)特，F(xiàn)值大于20，苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）含量不超過(guò)2%[5]；其較氨基酸產(chǎn)品更易被生物體利用[6-7]。其中，F(xiàn)值為支鏈氨基酸（BCAA）的摩爾數(shù)比芳香族氨基酸（AAA）的摩爾數(shù)[8]。大量研究表明，高F值寡肽不僅可以緩解肝性腦病，還具有解醉酒[9]、增強(qiáng)記憶[10]、抗疲勞[11]、抗氧化[12]及防衰老[13]等功效。早在20世紀(jì)70年代，Yamashita等[14]制得Phe含量低的肽，從此掀起了國(guó)內(nèi)外對(duì)高F值寡肽的研究熱潮。

本研究旨在借助超聲協(xié)同振蕩手段破壞蛋白質(zhì)分子間作用力，使其緊致結(jié)構(gòu)及聚集程度得到有效改善[15-17]，解決其在加熱溫度超過(guò)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）會(huì)聚成面團(tuán)的現(xiàn)象[18]，易于蛋白酶作用[16，19]，為有效利用其天然優(yōu)勢(shì)且高效制備高F值玉米寡肽提供有利條件，進(jìn)而推動(dòng)高F值寡肽的商品化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白：武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶：生工生物工程（上海）股份有限公司；α-胰凝乳蛋白酶：美國(guó)Amresco公司；羧肽酶A：美國(guó)Sigma公司；活性炭：寧夏天福盛園建設(shè)安裝有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

KX-85-2A數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：金壇市科析儀器有限公司；超聲振蕩儀、真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；UF101超濾納濾裝置：上海弗立特實(shí)業(yè)有限公司；NEXUS傅里葉變換紅外光譜：美國(guó)尼高力儀器公司；差示掃描量熱儀（DSC 204F1）：德國(guó)耐馳儀器制造有限公司；高速低溫離心機(jī)、SU1510掃描電鏡（SEM）、SU8220冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（FESEM）：日本日立HITACH集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白的預(yù)處理

1）各預(yù)處理方式對(duì)宏觀(guān)形態(tài)的影響 配制50 g/L的懸浮液，pH調(diào)至9.5。分別采用50℃水浴、亞硫酸鈉、吐溫、聚乙二醇、皂素、丙三醇、十二烷基磺酸鈉（SDS）、225 W超聲振蕩的方式進(jìn)行90 min預(yù)處理，以50 g/L玉米醇溶蛋白懸浮液在高于玻璃化溫度卻不聚成團(tuán)為指標(biāo)，選擇最佳預(yù)處理方式。

2）超聲振蕩對(duì)熱穩(wěn)定的影響 在張等[20]的測(cè)定方法上稍有改良，固態(tài)樣品的掃描范圍為30～200℃；50 g/L懸浮液的掃描范圍為20～80℃。Tg的計(jì)算參考卞[21]的方法。

3）超聲振蕩對(duì)微觀(guān)表面形貌的影響 取少量待測(cè)固態(tài)樣品固定在樣品臺(tái)上，噴金鍍膜處理，在高真空、5 kV的環(huán)境下，采用SEM在1 000、5 000倍下觀(guān)察其微觀(guān)表面形貌在超聲處理前后的變化。

用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇配制2 mg/mL質(zhì)量濃度的待測(cè)樣品，取少量滴于硅片上，自然干后固定在樣品臺(tái)上，噴金鍍膜處理后采用FESEM放大10 000倍，在高真空、3 kV的條件下觀(guān)察其微觀(guān)表面形貌在超聲處理前后的變化。

4）超聲振蕩對(duì)結(jié)構(gòu)的影響 參照董等[22]的測(cè)定方法。

1.3.2 玉米粗肽的制備

1）蛋白酶的選擇 將預(yù)處理后的玉米醇溶蛋白懸浮液分別調(diào)至各內(nèi)切酶最適的反應(yīng)溫度、pH條件，均以1×104U/g的酶底比加入各內(nèi)切酶且反應(yīng)2 h。利用水解度（DH）、游離態(tài)BCAA和AAA含量作衡量參數(shù)，選擇制備玉米粗肽（肽含量高且氨基酸組成特殊）的最佳蛋白酶。

2）Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶水解條件的優(yōu)化將超聲振蕩后的懸浮液調(diào)至50℃，pH調(diào)至8.0，分別以1×104、2×104、3×104、4×104、5×104U/g的酶底比添加Alcalase 2.4L堿性蛋白酶，反應(yīng)4 h，通過(guò)控制DH和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，對(duì)該酶的最佳酶底比和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

3）酶解液的膜過(guò)濾 將酶解液加入超濾納濾系統(tǒng)，選擇操作壓力為0.25 MPa，經(jīng)超濾（5 000）和納濾（500）收集相對(duì)分子質(zhì)量500～5 000的混合肽，冷凍干燥后進(jìn)行氨基酸測(cè)定和相對(duì)分子質(zhì)量分析。

1.3.3 高F值玉米寡肽的制備將膜過(guò)濾得到的凍干粉配制成50 g/L的玉米粗肽溶液，溫度維持在40℃，pH調(diào)至8.0，按酶底比2.0×104U/g加入α-胰凝乳蛋白酶，水解4 h；然后溫度調(diào)至37℃，pH調(diào)至7.0，按酶底比40 U/g加入羧肽酶A，水解2 h，然后進(jìn)行10 min的90℃酶失活處理；調(diào)pH至2.5，按炭液比為1∶15加入改性活性炭，調(diào)轉(zhuǎn)速至160 r/min，25℃處理2 h，然后離心取上清液，經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行氨基酸和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。

1.3.4 水解度測(cè)定采用甲醛滴定法，參照Wang等[23]的測(cè)定方法。

1.3.5 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測(cè)定采用BCA法微量測(cè)定，按照BCA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定及待測(cè)樣品的多肽質(zhì)量濃度測(cè)定。其中，反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為562 nm。

1.3.6 多肽分布測(cè)定參照齊等[24]的測(cè)定方法進(jìn)行待測(cè)樣品的多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定。

1.3.7 氨基酸質(zhì)量濃度測(cè)定游離態(tài)氨基酸參照朱等[25]的方法，總氨基酸參照尹等[26]的方法。

1.3.8 產(chǎn)品得率計(jì)算為保證工業(yè)轉(zhuǎn)化的高質(zhì)量運(yùn)行，則對(duì)小試階段的產(chǎn)品得率（Y）進(jìn)行計(jì)算，公式如下：

式中，Y為產(chǎn)品得率（%）；m1為高F值玉米寡肽質(zhì)量（g）；m2為玉米醇溶蛋白質(zhì)量（g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行測(cè)定，使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示結(jié)果，采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米醇溶蛋白的預(yù)處理

2.1.1 各處理方式對(duì)宏觀(guān)形態(tài)的影響Tg是非晶態(tài)高聚物的重要特征溫度之一，是從玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦邚棏B(tài)的溫度，是影響性能的主要因素[27-29]。由DSC圖譜可知，50 g/L玉米醇溶蛋白懸浮液的Tg為34.8℃（圖1（a））；固態(tài)玉米醇溶蛋白的Tg為107℃（圖1（b）），高于其50 g/L懸浮液的Tg，因?yàn)門(mén)g與樣品含水量呈負(fù)相關(guān)[18，30]；其Tg在超聲振蕩前后沒(méi)有顯著變化，而超聲振蕩后變性峰顯著減弱（圖1（b）），可能因?yàn)槌晠f(xié)同振蕩的空化與剪切作用削弱了蛋白質(zhì)的聚集程度而使其變得分散[31]。

圖1 超聲振蕩前后玉米醇溶蛋白的DSC圖譜Fig.1 DSC curves of zein before and after ultrasound oscillation pretreatment

作者發(fā)現(xiàn)50 g/L的玉米醇溶蛋白懸浮液在50℃加熱時(shí)會(huì)形成“粘彈性面筋團(tuán)”（圖2（b）），因?yàn)槠湓跍囟雀哂赥g時(shí)，會(huì)失去其固有結(jié)構(gòu)，通過(guò)蛋白質(zhì)的重排形成粘彈性體系[18]。該玉米醇溶蛋白懸浮液分別經(jīng)亞硫酸鈉、吐溫、聚乙二醇、皂素、甘油、SDS處理后，再經(jīng)過(guò)50℃加熱仍會(huì)聚成“粘彈性面筋團(tuán)”（圖2（b））；但經(jīng)超聲振蕩處理后，不僅解決了其在50℃聚成團(tuán)的難題（圖2（d）），且其凍干粉（圖2（c））較原玉米醇溶蛋白（圖2（a））顯著松散，由顆粒狀轉(zhuǎn)變?yōu)榉勰睢＝Y(jié)合DSC圖譜進(jìn)行綜合分析，則本研究選擇超聲振蕩作為降低該蛋白質(zhì)聚集程度的最佳處理方式。

圖2 不同預(yù)處理對(duì)玉米醇溶蛋白宏觀(guān)形態(tài)的影響Fig.2 Effects of different pretreatments on macroscopic morphology of zein

2.1.2 超聲振蕩對(duì)微觀(guān)表面形貌的影響從SEM和FESEM中觀(guān)察到：未經(jīng)超聲處理的玉米醇溶蛋白呈“海帶”狀，連接緊密，韌性強(qiáng)，表面光滑（圖3（a）和3（b）），且蛋白質(zhì)在70%乙醇中聚成球體，球的大小不等，球的頂端附有一層“薄膜”，球與球間連接緊密并盤(pán)旋成一團(tuán)（圖3（c）），這些聚集體也許就是其加熱成團(tuán)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；經(jīng)超聲振蕩處理后，其微觀(guān)表面形貌有顯著變化，由整體片狀型轉(zhuǎn)變?yōu)閴K狀堆積形態(tài)，由韌性變得松散，且表面出現(xiàn)了許多微小孔洞，增加了許多小突起（圖3（d）和3（e）），且在70%乙醇溶液中分散較好，球直徑顯著變小，球大小較均一，球表面失去了“薄膜”而變得光滑，且球與球間失去了緊密的盤(pán)旋而呈線(xiàn)狀（圖3（f））。蛋白質(zhì)松散度的提高為高效水解提供有利條件。超聲振蕩通過(guò)機(jī)械和空化作用、斷裂作用于蛋白質(zhì)分子間的范德華力和氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)[15，17]，這可能是玉米醇溶蛋白質(zhì)的微觀(guān)表面形貌經(jīng)超聲震蕩后顯著變化的根本原因，與DSC分析結(jié)果一致。

圖3 超聲振蕩前后玉米醇溶蛋白的SEM圖（a，b，d，e）和FESEM圖（c，f）Fig.3 SEM（a，b，d，e）and FESEM（c，f）images of zein before and after ultrasound oscillation pretreatment

2.1.3 超聲振蕩對(duì)結(jié)構(gòu)的影響如圖4（a）所示，超聲處理前后的玉米醇溶蛋白在4 000～400 cm-1的FTIR中均出現(xiàn)特征吸收帶，但強(qiáng)度存在差異。其中，蛋白質(zhì)的粘彈性和二級(jí)結(jié)構(gòu)通?；诓〝?shù)1 700～1 600 cm-1的FTIR分析（酰胺Ι帶）[32]，其特征振動(dòng)主要是C＝O起作用，且1 610～1 640 cm-1是β-折疊區(qū)域，1 640～1 650 cm-1是無(wú)規(guī)卷曲區(qū)域，1 650～1 658 cm-1是α-螺旋區(qū)域，1 660～1 700 cm-1是β-轉(zhuǎn)角區(qū)域[33]。如圖4（b）所示，超聲振蕩前后的玉米醇溶蛋白在酰胺Ι帶的吸收波形一致，但吸收強(qiáng)度在經(jīng)超聲振蕩后明顯減弱，這說(shuō)明其二級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)超聲振蕩后有很大程度的改變，但未被完全破壞。

圖4 超聲振蕩前后玉米醇溶蛋白的FTIR譜圖Fig.4 FTIR spectra of zein before and after ultrasound oscillation pretreatment

2.2 玉米粗肽的制備

2.2.1 蛋白酶的選擇選擇作用于A(yíng)AA的蛋白酶、采用內(nèi)外切酶協(xié)同水解是獲得高F值寡肽的關(guān)鍵。選用5種在A(yíng)AA處有酶切位點(diǎn)的內(nèi)切酶進(jìn)行初步水解（表1），在打開(kāi)緊致結(jié)構(gòu)的同時(shí)避免產(chǎn)生過(guò)多的游離氨基酸[34]。如圖5（a）所示，DH從大到小依次為：D、A、E、C、B。游離態(tài)氨基酸含量由多到少依次為：D、A、E、C、B（圖5（b）），與DH排序一致，D水解物的游離態(tài)氨基酸為1.86 mg/mL，其中，BCAA為0.87 mg/mL，AAA為0.37 mg/mL，均高于A(yíng)水解物（1.03、0.34、0.26 mg/mL），但游離態(tài)AAA/BCAA為0.42，低于A(yíng)水解物（0.76），可能因?yàn)槟竟系鞍酌敢簿邆渫馇忻傅淖饔肹35]。結(jié)合玉米醇溶蛋白的特性及各內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)，該步選用Alcalase 2.4L堿性蛋白酶進(jìn)行初步水解。

表1 不同內(nèi)切酶的作用位點(diǎn)Table 1 Action sites of different endoproteases

圖5 不同內(nèi)切酶水解玉米醇溶蛋白的DH及游離態(tài)氨基酸質(zhì)量濃度Fig.5 Degree of hydrolysis and free amino acids content of zein hydrolysed by different endoproteases

2.2.2 Alcalase 2.4L堿性蛋白酶酶解條件的優(yōu)化在DH和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度雙指標(biāo)的控制下，優(yōu)化水解時(shí)間和酶添加量，以達(dá)到高水解度且肽含量高的目標(biāo)。如圖6（a）所示，在其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（50 g/L）恒定的條件下，隨著酶添加量的增大，活性基團(tuán)增加，反應(yīng)增速，DH增大，但蛋白質(zhì)中可被酶作用的位點(diǎn)隨反應(yīng)的進(jìn)行而減少，當(dāng)反應(yīng)4 h時(shí)，水解過(guò)程基本達(dá)到飽和狀態(tài)，且以酶底比4×104U/g水解4 h的水解度（18.6%）與以酶底比5×104U/g水解4 h的水解度（19.66%）相近，而反應(yīng)超過(guò)3 h后，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度迅速降低（圖6（b））。因此，選用4×104U/g的酶底比對(duì)該松散蛋白質(zhì)進(jìn)行3 h的水解反應(yīng)，以保證得到肽含量較高的玉米粗肽。

圖6 Alcalase 2.4L堿性蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的蛋白質(zhì)水解度和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度Fig.6 Degree of hydrolysis and protein concentration of zein hydrolyzed by alkaline protease（Alcalase 2.4L）

2.2.3 Alcalase 2.4L堿性蛋白酶酶解液的超濾納濾將得到的酶解液經(jīng)超濾膜（5 000）和納濾膜（500）過(guò)濾，得到的粗肽中相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000的約占97.62%（圖7（a）和圖7（b））。其中，相對(duì)分子質(zhì)量500～1 000的肽占10.33%，180～500的肽占57.56%，小于180的物質(zhì)占29.73%（主要是二肽和游離氨基酸），見(jiàn)圖7（b）。同時(shí)對(duì)此粗肽進(jìn)行氨基酸組成分析，見(jiàn)表2。總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80.047 3%，游離態(tài)氨基酸8.924 9%且占比11.15%，結(jié)合圖7（b）分析，18.58%的小于180的物質(zhì)可能是二肽；另外，此肽混合物中BCAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.818 7%，AAA總量為7.852 2%，F(xiàn)值為4.07，見(jiàn)表2?？捎糜诟逨值玉米寡肽的制備，此F值高于何等[36]水解大豆與玉米復(fù)配蛋白質(zhì)制得的水解液的F值。另外，此粗肽混合物為短肽，便于α-胰凝乳蛋白酶協(xié)同羧肽酶A進(jìn)一步的定向且高效酶解[37]。

圖7 粗肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布和比例Fig.7 Molecular weight distribution and content of crude peptides

2.3 高F值玉米寡肽的制備

表2 粗肽的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Amino acid content of crude peptides %

按1.3.3所述方法制得高F值玉米寡肽混合物；以1.3.8所述公式算出此高F值玉米寡肽的得率為34.66%，高于林[38]制備高F值寡肽的得率，同時(shí)為后期工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)；以1.3.7所述方法進(jìn)行氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，見(jiàn)表3。此混合物中富含BCAA、AAA，被活性炭大量吸附，由7.852 2%降至0.42%，僅占氨基酸總量的0.73%，且F值由玉米粗肽的4.07提高到41.87，提高了10.29倍，高于使用這兩種酶水解大米[39]、螞蟥[40]、酪蛋白[41]制備高F值寡肽的F值。這一結(jié)果表明：此粗肽是制備高F值寡肽的優(yōu)質(zhì)肽源，此雙酶協(xié)同酶解能定向且高效釋放AAA，且AAA能被改性后的粉末活性炭高效除去。同時(shí)，以1.3.6所述方法進(jìn)行多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布分析，見(jiàn)圖8。由圖8（a）可知，此混合物的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中于1 000以下，約占97.68%，其中180～1 000的肽占比71.37%（圖8（b）），此相對(duì)分子質(zhì)量范圍的肽符合高F值寡肽的相對(duì)分子質(zhì)量要求，且易被人體吸收利用。

表3 高F值玉米寡肽的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Amino acid content of corn oligopeptides with a high Fischer"s ratio

圖8 高F值玉米寡肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布和百分比Fig.8 Molecular weight distribution and content of crude oligopeptides with a high Fischers ratio

3 結(jié)語(yǔ)

超聲振蕩使玉米醇溶蛋白的微觀(guān)表面形貌由片型韌狀轉(zhuǎn)變?yōu)閴K型松散狀，蛋白球狀體的聚集程度減弱且球直徑變小，二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定程度的破壞等一系列的變化。結(jié)果說(shuō)明超聲振蕩技術(shù)是通過(guò)改善玉米醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)特性而解決其加熱溫度高于Tg會(huì)形成“粘彈性面筋團(tuán)”的現(xiàn)象。該蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)松散狀態(tài)下易被Alcalase 2.4L堿性蛋白酶作用，提高了酶解效率，并通過(guò)超濾納濾膜分離、定向水解、活性炭脫芳香族氨基酸制得F值高達(dá)41.87，Phe和Tyr質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅占氨基酸總量的0.73%，相對(duì)分子質(zhì)量180～1 000占比71.37%的玉米寡肽。進(jìn)一步研究的重點(diǎn)是通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)研究該高F值玉米寡肽是否有糾正低蛋白血癥和預(yù)防早期肝損傷的功效，為來(lái)源于天然原料且具備特殊功效的高F值玉米寡肽的真正運(yùn)用奠定基礎(chǔ)。