基于計算機輔助水解和蛋白互作網(wǎng)絡的珍珠母寡肽作用機制解析

陳艷昆　喬連生　霍曉乾　張栩　韓娜　張燕玲

[摘要] 珍珠母蛋白及活性肽是珍珠母發(fā)揮療效的主要成分之一，解析其藥效物質(zhì)及作用機制具有重要研究意義。該研究利用計算機輔助水解和蛋白互作網(wǎng)絡等模擬技術，獲得珍珠母的活性寡肽成分，預測其潛在的作用靶標并解析珍珠母寡肽的作用機制。通過收集珍珠母的主要珍珠層蛋白序列，采用計算機輔助水解方法進行蛋白的模擬消化水解，構建了包含458條珍珠母水解寡肽的三維結構數(shù)據(jù)庫。隨后利用反向找靶技術預測珍珠母寡肽的作用靶點，并通過網(wǎng)絡富集技術法對排名前20的關鍵靶點及其蛋白互作關系進行分析，獲得12個功能模塊。從系統(tǒng)角度理解各種生物學過程，發(fā)現(xiàn)珍珠母寡肽的作用靶點與神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病有密切關系，提示珍珠母寡肽具有能治療中樞神經(jīng)類相關疾病的功效。計算機輔助水解方法可以高效地對已知序列結構的珍珠母蛋白進行模擬水解，并結合蛋白互作網(wǎng)絡，解析珍珠母寡肽治療神經(jīng)類疾病的作用機制。該研究為探討中藥寡肽類藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)及作用機制解析的提供研究思路，為開展寡肽類中藥設計研究提供了重要的技術支撐。

[關鍵詞] 計算機輔助水解； 珍珠母； 蛋白互作網(wǎng)絡； 反向找靶； 藥效團； 寡肽

Pharmacological mechanism analysis of oligopeptide from Pinctada fucata

based on in silico proteolysis and protein interaction network

CHEN Yankun， QIAO Liansheng， HUO Xiaoqian， ZHANG Xu， HAN Na， ZHANG Yanling*

（School of Chinese Material Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] Pinctada fucata oligopeptide is one of key pharmaceutical effective constituents of P. fucata. It is significant to analyze its pharmacological effect and mechanism. This study aims to discover the potential oligopeptides from P. fucata and analyze the mechanism of P. fucata oligopeptide based on in silico technologies and protein interaction network（PIN）. First， main protein sequences of P. fucata were collected， and oligopeptides were obtained using in silico gastrointestinal tract proteolysis. Then， key potential targets of P. fucata oligopeptides were obtained through pharmacophore screening. The proteinprotein interaction（PPI） of targets was achieved and implemented to construct PIN and analyze the mechanism of P. fucata oligopeptides. P. fucata oligopeptide database was constructed based on in silico technologies， including 458 oligopeptides. Twelve modules were identified from PIN by a graph theoretic clustering algorithm Molecular Complex Detection（MCODE） and analyzed by Gene ontology（GO） enrichment. The results indicated that P. fucata oligopeptides have an effect in treating neurological diseases， such as Alzheimer′s disease. In silico proteolysis could be used to analyze the protein sequences of traditional Chinese medicine（TCM）. According to the combination of in silico proteolysis and PIN， the biological activity of oligopeptides could be interpreted rapidly based on the known TCM protein sequence. The study provides the methodology basis for rapidly and efficiently implementing the mechanism analysis of TCM oligopeptides.

[Key words] in silico proteolysis； Pinctada fucata； PIN； reverse target identification； pharmacophore； oligopeptidesendprint

珍珠母為珍珠貝科動物馬氏珍珠貝Pinctada fucata的貝殼，收錄于《中國藥典》2015年版，其味咸性寒，歸肝、心經(jīng)，具有平肝潛陽、安神定驚、明目退翳的功效[1]。作為我國的傳統(tǒng)中藥，珍珠母的臨床應用始見于唐代陳藏器[2]的《本草拾遺》，“老蚌含珠，殼堪為粉。爛殼為粉，飲下，主反胃，心胸間痰飲”?？梢娬渲槟傅膽眯问匠檎渲槟阜勰，F(xiàn)代研究表明，珍珠母的有效成分不是占90%以上的碳酸鈣，而是其中少量的有機酸及活性蛋白[3]。在用藥過程中，珍珠母的活性蛋白可在腸道中經(jīng)消化水解形成活性寡肽，從而被吸收入血，發(fā)揮藥效。珍珠母寡肽具有較好的鎮(zhèn)靜、催眠、安神作用，多用于治療神經(jīng)類的疾病[4]。

本研究通過計算機輔助蛋白水解技術，模擬消化道的消化酶組成，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶共同虛擬水解[5]，獲得包含2～6肽的珍珠母虛擬水解寡肽，構建虛擬結構數(shù)據(jù)庫。隨后利用反向找靶技術，獲得珍珠母寡肽作用的潛在關鍵靶標。利用這些蛋白互作關系信息構建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（protein interaction network，PIN），對網(wǎng)絡進行功能模塊分析，以期從分子水平解析珍珠母寡肽治療神經(jīng)類疾病的作用機制，為臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 珍珠母蛋白的模擬水解及寡肽數(shù)據(jù)庫構建 本研究以馬氏珍珠貝Pinctada fucata為檢索詞，通過在NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中對其所含的主要儲存蛋白質(zhì)進行檢索。研究表明，珍珠母中所含蛋白質(zhì)主要為馬氏珍珠貝的珍珠層蛋白nacrein，N16與N19等[69]。

本研究收集其蛋白序列688條，其中包括有大量由于核苷酸多態(tài)性引起的多樣性蛋白序列。本研究采用BIOPEP（http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index. php/pl/biopep）對獲得的蛋白序列進行計算機輔助模擬水解，以預測珍珠層蛋白序列的切割位點。實驗采用模擬胃腸道消化水解的策略，選擇胃蛋白酶（pH 1.3）、胰蛋白酶和糜蛋白酶作為消化酶共同虛擬水解。基于獲得的切割位點進一步分解蛋白序列，選擇其中2～6肽的分子并利用Discovery Studio 4.0（DS）進行寡肽三維結構數(shù)據(jù)庫的構建[10]。

1.2 珍珠母寡肽的反向找靶研究 由于本文進行天然寡肽的模擬水解，因此選擇天然立體構型的氨基酸來構建寡肽分子，即L型氨基酸，最后通過Minimize ligands對寡肽分子進行能量最小化分析，在CHARMm力場下加載MomanyRone電荷，采用最陡下降法和共軛梯度法相結合的能量優(yōu)化算法，獲得寡肽的最低能量構象。隨后對寡肽分子進行多構象的生成，選擇BEST模式，生成255個構象，從而生成珍珠母寡肽三維結構數(shù)據(jù)庫。本研究基于DS軟件中PharmaDB數(shù)據(jù)庫的藥效團模型，進行反向找靶研究[1112]。搜索方式選擇柔性搜索，以匹配打分值0.9為截斷值，計算每個靶標的打分值總和，從而評價珍珠母寡肽潛在的作用靶標，進一步構建其蛋白互作網(wǎng)絡。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡的構建 珍珠母寡肽的潛在作用靶標的蛋白質(zhì)相互作用信息來源于String數(shù)據(jù)庫（http：//stringdb.org/）[13]，包含已知的和預測的人源蛋白質(zhì)相互作用信息。在String中，對每一個蛋白相互作用都有一個打分值，打分值越高，則數(shù)據(jù)越可靠，本文選取打分值大于0.9且排名前20的高置信度的PPI數(shù)據(jù)，以確保結果的可靠性。將獲得的全部蛋白相互作用數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.4.0[14]軟件，對每個靶點的蛋白互作網(wǎng)絡進行union[15]計算，從而將獨立的各個靶標的蛋白互作信息進行整合，去除孤立點、重復邊和自環(huán)邊，構建珍珠母寡肽的蛋白互作網(wǎng)絡。

1.4 蛋白模塊分析 蛋白質(zhì)通過彼此之間相互作用結合成一個團體來完成其生物學功能，這些緊密聯(lián)系的團體稱之為蛋白復合體或功能模塊。本研究采用基于復合檢測算法（MCODE）[16]對蛋白網(wǎng)絡進行模塊分析。其中，決定識別模塊大小的參數(shù)KCore設置為3，即至少包含4條邊。并利用BinGO插件[17]對識別出的模塊進行功能注釋，其中顯著性選擇0.05，基因本位信息及注釋信息均來自Gene Ontology （http：//www.geneontology.org/）。BinGO使用的統(tǒng)計檢驗方法為超幾何檢驗，該檢驗方法用P表示一組基因?qū)儆谕换虮疚坏母怕?，P越小說明一組基因?qū)儆谕换虮疚坏母怕试酱?。本研究對識別獲得模塊的注釋結果進行模塊功能的分析，有助于從系統(tǒng)角度理解各種生物學過程，解釋珍珠母寡肽的作用機制。

2 結果與討論

2.1 珍珠母寡肽庫的構建 本研究對珍珠母珍珠層主要蛋白序列進行計算機水解預測，針對其中具有較好的相對分子質(zhì)量與成藥性的2～6肽構建了包含458條珍珠母水解寡肽的數(shù)據(jù)庫。其中各段寡肽的數(shù)目分布見圖1。

2.2 反向找靶 通過DS軟件的Ligand Profiler功能對得到的珍珠母層蛋白與PharmaDB數(shù)據(jù)庫的藥效團模型進行反向找靶。以匹配打分值0.9為截斷值，計算每個靶標的打分值總和。截取打分值總和排名前20的靶標進行進一步分析。關鍵靶點及對應的基因信息及打分值見表1。將篩選得到的關鍵靶點與珍珠母層蛋白進行相互匹配，得到珍珠母與藥效團的匹配熱度圖2。橫坐標代表20個藥效團模型，縱坐標代表458個寡肽。不同色度變化表示相互作用不同，從藍色到紅色，表示珍珠母寡肽與靶標的相互作用逐漸增強。

2.3 珍珠母寡肽蛋白互作網(wǎng)絡 本研究構建的珍珠母寡肽的蛋白互作網(wǎng)絡見圖3，包含251節(jié)點、1 112條邊?；贛CODE方法對網(wǎng)絡進行模塊分析，共獲得12個功能模塊，見圖4，其中，運用BinGO對模塊進行注釋，獲得的主要生物過程見表2。endprint

2.4 蛋白模塊分析 通過模塊分析，珍珠母寡肽主要參與的生物過程有G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、對刺激的細胞應答、細胞有絲分裂周期間期、基于腎素血管緊張素的動脈血壓調(diào)節(jié)、β淀粉樣蛋白代謝通路等。其中，與神經(jīng)系統(tǒng)直接相關的模塊包括模塊1和模塊12，與心血管系統(tǒng)直接相關的模塊包括模塊1、模塊2、模塊3和模塊8，與細胞遷移相關的模塊包括模塊9和模塊10，與細胞應答相關的模塊包括模塊7和模塊10。珍珠母具有平肝潛陽、安神定驚的傳統(tǒng)功效[18]，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關。因此，本研究針對G蛋白偶聯(lián)受體信號通路模塊1和β淀粉樣蛋白代謝通路模塊12，探討珍珠母寡肽針對中樞神經(jīng)類疾病的治療作用。

核心靶點之一。5HT2A介導的G蛋白偶聯(lián)受體信號通路在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能中具有重要作用[19]，其與人類多種精神活動密切相關，是治療抑郁癥、焦慮癥、失眠等神經(jīng)類疾病的關鍵靶點[20]。研究表明5HT2A與mGluR的活性高度相關，mGluR可以調(diào)節(jié)5HT2A的活性，從而共同調(diào)控機體對神經(jīng)興奮的反應[2122]。研究發(fā)現(xiàn)[23]，低濃度的NPS通過直接作用于5HT2A來選擇性的抑制5HT的釋放，從而影響機體在神經(jīng)系統(tǒng)的活動。5HT2A水平降低導致的情志低迷對應的中醫(yī)證型之一為心腎不交型，其癥狀多見情緒抑郁，心悸，健忘，失眠多夢，煩躁多汗等[24]。《靈樞經(jīng)·邪客》云：“心者，五臟六腑之大主也，精神之所舍也”，可見人的意識、精神、思想活動與心關系密切。針對這種中醫(yī)證型，珍珠母具有良好的治療效果[25]。珍珠母歸心經(jīng)，具有安神定驚的傳統(tǒng)功效，臨床上珍珠母可用于治療神經(jīng)類疾病如驚悸怔忡、心神不寧、失眠健忘等?！侗静菥V目》[26]中記載珍珠母可“安魂魄，止遺精白濁，解痘療毒”。結合本實驗的研究結果，珍珠母寡肽可調(diào)節(jié)關鍵蛋白5HT2A的功能，提示珍珠母寡肽具有潛在的治療驚悸失眠，心神不寧等神經(jīng)類疾病的作用。

模塊12代表的β淀粉樣蛋白代謝通路，包括β分泌酶1（beta secretase 1，BACE1）、Nicastrin蛋白（nicastrin）和早老素1（presenilin1，PSEN1）等，與神經(jīng)類疾病如阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）有密切關系。其中，BACE1是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要靶點之一，因其是生成β淀粉樣蛋白（Aβ）過程中的關鍵限速酶。Aβ的沉積被認為是導致神經(jīng)元傷害的重要原因。本實驗發(fā)現(xiàn)，珍珠母寡肽可通過作用于BACE1發(fā)揮作用。BACE1敲除的小鼠不能產(chǎn)生Aβ，且小鼠生理及解剖學健康不受影響，因此BACE1是治療神經(jīng)類疾病AD的潛在重要靶標[27]。Nicastrin[28]和PSEN1[29]均為γ分泌酶的重要組成部分，而γ分泌酶能夠促進Aβ的產(chǎn)生。因此，對Nicastrin和PSEN1功能的認識和了解可能為γ分泌酶及AD相關藥物開發(fā)帶來新的認識。AD在中醫(yī)學中屬于“呆病”，肝陽上亢型為AD的主要證型之一，癥狀多見煩躁易怒，頭暈健忘等。針對這種AD的證型，平肝潛陽法為其主要治法[30]。珍珠母歸肝經(jīng)，具有平肝潛陽，重鎮(zhèn)安神之功效?！讹嬈聟ⅰ穂31]中記載珍珠母可“平肝潛陽，安神魂，定驚癇?！薄吨袊t(yī)學大辭典》中記載珍珠母“入肝經(jīng)，可滋肝陰，清肝火，治癲狂驚癇，頭眩等”。結合本實驗研究，進一步發(fā)現(xiàn)珍珠母寡肽可調(diào)節(jié)關鍵蛋白BACE1發(fā)揮作用，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病如AD的藥效，有助于部分揭示珍珠母寡肽的作用機制。

3 結論

本研究基于計算機輔助水解方法，對珍珠母中的蛋白質(zhì)進行模擬消化水解，獲得并構建了包含458個珍珠母寡肽三維結構數(shù)據(jù)庫。隨后，利用反向找靶技術，對珍珠母寡肽作用的前20個作用靶標進行網(wǎng)絡富集及蛋白相互作用的分析，發(fā)現(xiàn)了12個功能模塊。這些功能模塊與神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、細胞遷移與應答等有關。其中，5HT2A介導的G蛋白偶聯(lián)受體信號通路模塊和β淀粉樣蛋白代謝通路模塊與神經(jīng)系統(tǒng)直接相關。模塊中的珍珠母寡肽作用的關鍵蛋白如5HT2A和BACE1等可以調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌、抑郁、鎮(zhèn)靜、焦慮以及AD等疾病的過程，提示珍珠母寡肽能夠治療失眠、焦慮、AD等疾病。對于本文的研究結果，還需要進一步分析珍珠母寡肽是否能吸收入血，同時寡肽化合物活性需要進行生物實驗驗證。本文通過聯(lián)合計算機輔助水解技術和蛋白互作網(wǎng)絡方法，闡釋珍珠母寡肽治療中樞神經(jīng)類疾病的作用機制。同時也為探討快速、高效開展中藥來源的肽類物質(zhì)的活性機制研究提供了方法學依據(jù)。

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[責任編輯 張寧寧]endprint