氧化苦參堿對H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

張仲柏，李艷春，陳潤都，李園鑫，張 梅

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)是指冠狀動脈粥樣斑塊形成使血管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺血、缺氧而引起的心臟病。CAD在全球的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，同時(shí)氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)被認(rèn)為是一個(gè)明確促進(jìn)細(xì)胞凋亡的病理過程，與多種心血管疾病密切相關(guān)[1，2]。因此，探究CAD的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的預(yù)防及治療途徑顯得尤為重要。

氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)是從苦參和苦豆子中提取出來的生物堿，具有抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠等多種藥理作用[3-5]，另外OMT在心血管領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用前景，如調(diào)節(jié)血壓、抗心律失常、抗病毒性心肌炎等[6-8]。隨著國內(nèi)外學(xué)者大量研究，OMT對心血管疾病的保護(hù)機(jī)制也逐漸被揭曉[9-11]，心肌組織核因子相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)/血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)信號通路是人體內(nèi)重要的抗氧化通路[12]，但OMT在心肌細(xì)胞OS損傷中的保護(hù)機(jī)制與該通路的關(guān)系尚未明確，因此，本研究通過建立H9c2心肌細(xì)胞OS損傷模型，探討OMT對心肌細(xì)胞OS損傷的保護(hù)作用與Nrf2 /HO-1信號通路的關(guān)系，進(jìn)一步了解OMT保護(hù)心肌細(xì)胞的作用機(jī)制并對臨床開發(fā)新藥做出指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞系 H9c2心肌細(xì)胞株取自本實(shí)驗(yàn)室，接種于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，并放置于含5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。

1.1.2 主要材料與試劑 高糖DMEM 培養(yǎng)液(美國Gibco公司) ，胎牛血清(美國Gibco公司)，磷酸鹽(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液(北京Solarbio有限公司)，過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)試劑(美國Sigma公司)，BCA蛋白定量試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA) 、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、過氧化氫酶(catalase，CAT)檢測試劑盒 (南京建成生物工程研究所) ，Nrf2、HO-1、β-actin抗體(美國Proteintech Group公司)，HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗(美國Proteintech Group公司)，TRIzol Reagent細(xì)胞裂解液(美國Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，PCR引物(北京生工生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，隨機(jī)分為4組：對照組，不給于任何處理；模型組，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)4 h；OMT低、高濃度預(yù)處理組，分別用含有10 μmol/L和50 μmol/L的OMT且不含有血清的DMEM完全培養(yǎng)液預(yù)處理12 h，再加入終濃度為100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)4 h。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 各組細(xì)胞800 r/min離心5 min后棄上清，PBS緩沖液沖洗2～3次后用去離子水進(jìn)行洗滌，加入蘇木精浸染5 min，用去離子水沖洗后置入伊紅液中2 min，置于通風(fēng)處晾干后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞個(gè)數(shù)，并進(jìn)行拍照。

1.2.3 Hoechst凋亡染色 將各組細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于24孔板內(nèi)，放置于含5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后按照上述實(shí)驗(yàn)方法分別對細(xì)胞進(jìn)行處理并吸盡培養(yǎng)液，根據(jù)Hoechst3325S染色試劑盒說明書，每孔加入固定液后，置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜。去除固定液時(shí)避光、搖床上用PBS緩沖液洗滌2～3遍，再加入Hoechst染色液孵育5 min，隨后吸去染色液并用PBS緩沖液洗滌2～3遍，最后滴入封片液封片，同時(shí)在340 nm波長的紫外光下激發(fā)，觀察熒光強(qiáng)弱。

1.2.4 細(xì)胞活力的檢測 采用MTT法。將各組細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，接種完畢后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞完全貼壁后按照上述實(shí)驗(yàn)方法分別對不同分組的細(xì)胞進(jìn)行處理。隨后加入濃度為5 g/L MTT溶液20μL，培養(yǎng)箱孵育4 h后棄上清，并在每孔中加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μl，振蕩10 min后用酶標(biāo)儀測定490 nm波長的OD值，各組取平均值后計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD 值)×100%。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH水平的檢測 取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒操作步驟，通過全自動化酶標(biāo)儀檢測每組細(xì)胞上清液中的LDH含量。

1.2.6 心肌細(xì)胞中SOD、MDA、GSH、CAT水平的檢測 取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，在6孔板中每孔加入2 ml PBS洗滌2～3次，采用超聲破碎儀冰水浴中破碎細(xì)胞， 3～5 s超聲1次，間隔4次，而后經(jīng)4 ℃離心機(jī)1500 r/min離心4 min取上清，最后按照不同試劑盒的操作步驟采用全自動化酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞裂解液中SOD、MDA、GSH、CAT水平。

1.2.7 RT-PCR檢測Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、Casepase3 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá) 通過Trizol法提取各組心肌細(xì)胞的信使RNA(messenger RNA，mRNA)，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementary DNA，cDNA)，最后以cDNA為模板，采用RT-PCR法檢測各組中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/ leukemias-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)蛋白X(bcl-2 associated x protein，Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Casepase3)、Nrf2、HO-1 mRNA的表達(dá)。

1.2.8 Western Blot檢測Nrf2 、HO-1蛋白表達(dá) 按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2～3次，收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液4 ℃裂解20 min，離心后收集細(xì)胞上清液。用BCA蛋白測定盒測定蛋白總量。取細(xì)胞裂解液上清樣于SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride，PVDF)膜上。加入封閉液、一抗4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗工作液室溫進(jìn)行孵育1 h，洗膜，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測靶蛋白的表達(dá)。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 OMT對OS損傷的H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)的影響 對照組心肌細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞呈長梭形、胞質(zhì)飽滿且結(jié)構(gòu)完整，胞漿透明，細(xì)胞排列緊密，貼壁良好(圖1A)。模型組出現(xiàn)大量懸浮細(xì)胞，鏡下顯示細(xì)胞明顯失去基本結(jié)構(gòu)，皺縮明顯，胞間間隙增大(圖1B)。細(xì)胞在低、高濃度OMT預(yù)處理后狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，基本結(jié)構(gòu)較清晰，胞間間隙縮小(圖1C、D)。

圖1 不同濃度的OMT對H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)的影響(HE, ×100)

A．對照組；B.模型組; C. OMT 10 μmol/L預(yù)處理組; D. OMT 50 μmol/L預(yù)處理組

2.2 OMT對OS損傷的H9c2心肌細(xì)胞存活率及LDH漏出量的影響 模型組心肌細(xì)胞存活率較對照組降低，LDH漏出量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)OMT低、高濃度預(yù)處理后心肌細(xì)胞較模型組存活率升高, LDH漏出量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

組別存活率(%)LDH(U/L)對照組97.25±0.11158.63±8.53模型組39.53±0.25①472.22±15.54①OMT 10 μmol/L預(yù)處理組57.40±0.12②367.72±12.53②OMT 50 μmol/L預(yù)處理組77.51±0.23②275.35±12.48②

注：與對照組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

2.3 OMT對OS損傷的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響 模型組心肌細(xì)胞較對照組胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞核內(nèi)可見大量藍(lán)色熒光(圖2A、B)，通過計(jì)算凋亡率，模型組高于對照組[(86.65%±4.31%)vs(11.08%±3.21%)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)OMT低、高濃度預(yù)處理后細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)，細(xì)胞核內(nèi)藍(lán)色熒光減少，凋亡率下降(圖2C、D)[(49.02%±4.21%)vs(35.60%±2.62%)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 不同濃度的OMT對H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響(Hoechst, ×100)

A．對照組；B.模型組; C. OMT 10 μmol/L預(yù)處理組; D. OMT 50 μmol/L預(yù)處理組

2.4 OMT對OS損傷的H9c2心肌細(xì)胞中SOD、MDA、GSH、CAT含量的影響 與對照組比較， 模型組心肌細(xì)胞胞內(nèi)SOD、GSH、CAT含量降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，經(jīng)OMT低、高濃度預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH、CAT含量升高，MDA含量下降，且隨著藥物濃度的增加變化顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

2.5 OMT對OS損傷的H9c2心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、Casepase3 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)影響 通過RT-PCR檢測分析發(fā)現(xiàn)，模型組較對照組心肌細(xì)胞中Bax mRNA、Casepase3 mRNA表達(dá)升高，Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)呈上升趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)OMT低、高濃度預(yù)處理后心肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)較模型組升高， Bax mRNA、Casepase3 mRNA表達(dá)較模型組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

組別SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)GSH(μmol/gprot)CAT(U/ml)對照組193.05±7.541.33±0.0760.46±0.9950.72±1.24模型組64.51±5.37①6.70±0.05①28.43±1.72①21.26±1.01①OMT 10 μmol/L預(yù)處理組90.55±2.27②4.75±0.09②36.87±1.17②34.74±2.41②OMT 50 μmol/L預(yù)處理組130.52±5.94②3.22±0.03②44.69±1.96②44.71±1.66②

注：與對照組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

組別Bcl-2BaxCasepase3Nrf2HO-1對照組11111模型組0.33±0.31①2.13±0.11①3.61±0.43①1.59±0.27①1.51±0.46②OMT 10 μmol/L預(yù)處理組0.68±0.43④1.83±0.21④2.71±0.32③1.98±0.33④1.91±0.38④OMT 50 μmol/L預(yù)處理組0.81±0.26③1.63±0.47③1.91±0.57③2.24±0.21③2.22±0.41③

注：與對照組比較，①P<0.01，②P<0.05；與模型組比較，③P<0.01，④P<0.05

2.6 OMT對OS損傷的H9c2心肌細(xì)胞Nrf2 、HO-1蛋白表達(dá)的影響 Western Blot結(jié)果顯示，模型組心肌細(xì)胞較對照組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，OMT低、高濃度預(yù)處理組心肌細(xì)胞Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)呈上升趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3，表4)。

圖3 不同濃度OMT對H9c2心肌細(xì)胞OS損傷后Nrf2和HO-1的western blot 結(jié)果

A. 對照組；B.模型組; C. OMT 10 μmol/L預(yù)處理組; D. OMT 50 μmol/L預(yù)處理組

組別Nrf2HO-1對照組0.87±0.050.54±0.04模型組1.57±0.03①0.73±0.03①OMT 10 μmol/L預(yù)處理組1.88±0.03②0.94±0.03②OMT 50 μmol/L預(yù)處理組1.94±0.05②1.06±0.01②

注：與對照組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

3 討 論

OS的實(shí)質(zhì)是體內(nèi)氧自由基(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多，超過了自身清除能力而發(fā)生的溶酶體、線粒體等損傷[13]。H2O2是體內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物之一，通過與細(xì)胞核內(nèi)的鐵離子反應(yīng)從而產(chǎn)生活性較強(qiáng)的氧自由基引起細(xì)胞損傷，同時(shí)它還能夠通過脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物MDA促進(jìn)蛋白質(zhì)聚合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。

凋亡即一種程序性死亡，形態(tài)學(xué)變化以細(xì)胞皺縮、核溶解及 DNA 斷裂為特征[15]。心肌細(xì)胞凋亡以線粒體凋亡途徑為主，該途徑主要由Bcl-2家族參與。Bcl-2家族主要由促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2組成，通過調(diào)節(jié)線粒體膜通透性來確定細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡的程度[16]。Caspase家族在細(xì)胞凋亡中同樣發(fā)揮著重要作用，當(dāng)Bax結(jié)合到線粒體膜時(shí)，線粒體內(nèi)外膜之間的離子濃度發(fā)生改變使細(xì)胞色素C流到細(xì)胞質(zhì)中，與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Casepase 9)形成凋亡體并激活Caspase 3誘發(fā)細(xì)胞凋亡[17]。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)OMT能夠增加Bcl-2，降低Bax和Casepase 3的mRNA表達(dá)量，該結(jié)果與趙陽[11]實(shí)驗(yàn)的蛋白水平表達(dá)結(jié)果相吻合，說明OMT可以通過抑制線粒體凋亡途徑保護(hù)心肌細(xì)胞。另外本次實(shí)驗(yàn)又分別通過形態(tài)學(xué)染色、Hoechst凋亡染色等對該結(jié)論進(jìn)行補(bǔ)充說明，更加全面地論證OMT這一保護(hù)機(jī)制。

正常生理狀態(tài)下，血清中LDH含量較低，僅在細(xì)胞膜損傷后細(xì)胞內(nèi)的LDH才能夠大量釋放，同時(shí)SOD作為體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化劑，可以清除體內(nèi)過多的氧自由基，減少線粒體損傷，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[18，19]。研究發(fā)現(xiàn)OMT預(yù)處理組的細(xì)胞上清液中LDH含量和細(xì)胞內(nèi)MDA含量較模型組顯著下降，細(xì)胞內(nèi)SOD含量明顯升高，說明OMT具有良好的抗氧化損傷作用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)論與趙陽[11]的研究結(jié)論也符合，另外通過對細(xì)胞內(nèi)其他抗氧化劑GSH、CAT的含量進(jìn)行測定也得出了相同結(jié)論，充分證明了OMT提升細(xì)胞抗氧化能力的作用。但OMT在心肌細(xì)胞損傷中的抗氧化機(jī)制目前并不清楚，同時(shí)這也是本次實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)，希望通過進(jìn)一步了解OMT的保護(hù)機(jī)制為今后研發(fā)新型抗心肌損傷藥物提供新的參考方向。

正常情況下Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1重組蛋白(recombinant kelch like ECH associated protein 1，Keap1)以無活性的二聚體形式存在，受到OS損傷后迅速與Keap1分離并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，通過啟動下游能夠編碼抗氧化蛋白基因和Ⅱ相抗氧化酶HO-1等的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用[20]。同時(shí)有研究表明，Nrf2還能夠上調(diào)Bcl-2的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用[21]。本次實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR與Western Blot分別從RNA與蛋白水平上發(fā)現(xiàn)OMT能夠通過增加Nrf2的核轉(zhuǎn)移和下游基因HO-1的表達(dá)發(fā)揮抗氧化作用，表明OMT的抗氧化作用可能與Nrf2/ HO-1信號通路有關(guān)。但通過上游哪些基因轉(zhuǎn)錄激活Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，同時(shí)產(chǎn)生哪些細(xì)胞因子促使其激活下游HO-1目前尚不清楚，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)加以研究探討。

綜上所述，OMT對OS損傷的H9c2心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與OMT上調(diào)Nrf2/ HO-1信號通路，提高心肌細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH、CAT等抗氧化酶活性，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。希望通過對OMT分子機(jī)制的研究使其作用靶點(diǎn)逐漸明確，為今后臨床用藥提供理論依據(jù)。