嬰幼兒配方粉中克羅諾桿菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王倩寧 劉艷梅 王弋博 王廷璞

摘要：近克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）是一種新發(fā)現(xiàn)的食源性致病菌，能引起嬰幼兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎，致死率高.因此，建立準(zhǔn)確、快速、有效的檢測(cè)方法已成為克羅諾桿菌研究的首要任務(wù).闡述了克羅諾桿菌的分類和檢測(cè)研究進(jìn)展，將傳統(tǒng)生化檢測(cè)、分子層面和免疫層面檢測(cè)方法進(jìn)行匯總對(duì)比，為進(jìn)一步優(yōu)化克羅諾桿菌的檢測(cè)體系提供參考.

關(guān)鍵詞：克羅諾桿菌;檢測(cè)方法;研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：TS207.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2020）02-0036-07

食品安全是一個(gè)重大的全球性公共衛(wèi)生問題，由致病菌引起的食源性疾病是當(dāng)前最主要的食品安全問題.克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）是新發(fā)現(xiàn)的一種食源性致病菌，分布廣泛，在嬰幼兒乳制品、鮮蔬菜、谷類、調(diào)味料及肉制品等多種食品中均被檢出過[1]，該菌是一種條件性致病菌，致死率高達(dá)40-80%[2]，主要癥狀為嬰幼兒腦膜炎、菌血癥和小腸結(jié)腸炎等[3]，克羅諾桿菌被國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)列為“嚴(yán)重危害特定人群，危害生命或慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥或長(zhǎng)期影響”的一種致病菌[4].目前還尚未確定克羅諾桿菌的宿主和傳播途徑，分析全球范圍內(nèi)報(bào)道的嬰幼兒感染事件，表明嬰幼兒配方粉是該菌的主要感染源[5].因此，建立快速有效的檢測(cè)方法已成為克羅諾桿菌研究的主要內(nèi)容之一.目前，國(guó)內(nèi)外克羅諾桿菌的檢測(cè)方法主要有常規(guī)生化檢測(cè)方法、分子生物學(xué)檢測(cè)法和免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法.此文旨在從分類和檢測(cè)方法兩個(gè)方向來闡述克羅諾桿菌的研究進(jìn)展，為研究克羅諾桿菌的有效檢測(cè)方法提供更全面的參考.

1 克羅諾桿菌分類

克羅諾桿菌是一種寄生在人和動(dòng)物腸道內(nèi)，周身鞭毛、無芽孢的兼性厭氧型革蘭氏陰性菌.初名黃色陰溝腸桿菌，直到1980年，F(xiàn)armer等[6]人對(duì)腸桿菌進(jìn)行DNA雜交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)原黃色陰溝腸桿菌菌株之間DNA互補(bǔ)程度高達(dá)83-89%，與陰溝腸桿菌一致性僅為31-49%，結(jié)合生化反應(yīng)、色素產(chǎn)物及抗生素敏感性等分析，F(xiàn)armer等將其定義為腸桿菌屬的一個(gè)新種，并建議更名為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）.隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Iverson等[7-8]根據(jù)16S rRNA基因序列特征、DNA雜交、核糖體分型以及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性熒光標(biāo)記，對(duì)阪崎腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析，提議將該菌劃分為一個(gè)新屬——克羅諾桿菌屬（Cronobacter gen. nov）.該屬由1個(gè)新組合Cronobacter sakazakii;4個(gè)新種及l(fā)個(gè)基因種（Cronobacter genomospecies 1）組成.2012年Joseph等[9]對(duì)5株克羅諾桿菌的表型分型、7個(gè)管家基因的多位點(diǎn)序列進(jìn)行分析和16S rRNA基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新種，尤尼沃斯克羅諾桿菌（Cronobacter universalis）和康帝蒙提克羅諾桿菌（Cronobacter condimenti），其中尤尼沃斯克羅諾桿菌代替之前的基因種.目前，克羅諾桿菌屬包括7個(gè)種（見表1），和3個(gè)都柏林亞種（Cronobacter dublinensissubsp. Dublinensis），乳粉亞種（Cronobacter dublinensissubsp. Lactaridi）和洛桑亞種（Cronobacter dublinensissubsp. Lausannens）.

2 克羅諾桿菌的檢測(cè)方法

2.1 傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法

克羅諾桿菌的傳統(tǒng)分離檢測(cè)方法，首先進(jìn)行富集培養(yǎng)，再進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，經(jīng)分離純化后得到目標(biāo)菌株，此方法依據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和生化鑒定結(jié)果進(jìn)行檢測(cè).

目前克羅諾桿菌主要的生理生化檢測(cè)方法有3種：美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）方法、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（druggan-forsythe-iversen，DFI）方法和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.40-2016.

國(guó)際上首個(gè)官方檢測(cè)方法是美國(guó)FDA在2002年制定的“嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的分離和計(jì)數(shù)”（此前名為阪崎腸桿菌）[10].檢測(cè)時(shí)，在無菌條件下每個(gè)奶粉樣品分別稱取100g、10g和1g各3份，以1∶10稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，取10mL混合液接種到90mL無菌腸桿菌增殖（enterobacteria enrichment broth，EE）肉湯中，37℃孵育過夜;后取適量增菌液劃線于結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖培養(yǎng)基（violet red bile glucose agre，VRBGA）上，37℃過夜培養(yǎng).挑取5個(gè)典型或疑似菌落劃線接種于大豆酪蛋白培養(yǎng)基（tryptose soya agar，TSA）上，25℃培養(yǎng)48-72h.用API 20E試劑條對(duì)TSA上的黃色菌落進(jìn)行生化鑒定[11].該法需要7d左右的檢測(cè)時(shí)間，且有些克羅諾桿菌與某些腸桿菌科菌株的菌落形態(tài)和顏色在VRBGA培養(yǎng)基上差異小，挑取難度較高，存在誤檢和漏檢的風(fēng)險(xiǎn).再者，有些克羅諾桿菌在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后菌體產(chǎn)生的黃色色素深淺不一，不易判定，也增加了誤檢和漏檢的風(fēng)險(xiǎn).

Guillaume-Genti等[12]將FDA方法中的EE肉湯更換為10mg/L改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素（modified lauryl sulfate tryptose vancomycin medium，mLST-Vm）.隨后的生理生化檢測(cè)研究中在該法的基礎(chǔ)上將選擇性培養(yǎng)基VRBGA改進(jìn)為阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基DFI，DFI培養(yǎng)基中加入了發(fā)色集團(tuán)5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷（Xa-Glc），提高了檢測(cè)的特異性.國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)微生物委員會(huì)以此方法為檢測(cè)嬰幼兒配方粉的技術(shù)規(guī)范，即ISO/TS 22964-2006“乳和乳制品中阪崎腸桿菌的檢測(cè)”[13].該方法用mLST-Vm和添加了顯色劑Xa-Glc的DFI瓊脂代替FDA方法中的EE肉湯和VRBGA，提高了阪崎腸桿菌的檢出率[14-15].中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.40-2016“克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)”中，以mLST-Vm和阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基作為選擇性增菌和選擇性分離的培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè).

2.2 分子生物學(xué)檢測(cè)法

常用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法有普通聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法、實(shí)時(shí)定量PCR法和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等.分子生物學(xué)檢測(cè)方法解決了傳統(tǒng)方法實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等問題.

2.2.1 普通PCR

2003年Keyser等[16]以阪崎腸桿菌16S rRNA -23S rRNA區(qū)域序列（ITS）為分子靶點(diǎn)，首次建立了阪崎腸桿菌的快速PCR檢測(cè)方法.隨后Lehner等[17]發(fā)現(xiàn)Keyser制定的PCR檢測(cè)方法特異性不高，出現(xiàn)陰溝腸桿菌假陽(yáng)性和莫金斯克羅諾桿菌假陰性的結(jié)果.針對(duì)這個(gè)問題，Lehner等研究克羅諾桿菌16S rRNA序列并建立進(jìn)化樹，形成了特異性強(qiáng)、高靈敏度的PCR檢測(cè)系統(tǒng)，靈敏度高達(dá)10pg.

為了建立最適的阪崎腸桿菌PCR檢測(cè)方法.Nair等[18]通過克隆阪崎腸桿菌的外膜蛋白A（ompA）基因，建立了單重PCR快速檢測(cè)法，檢測(cè)結(jié)果顯示該方法對(duì)克羅諾桿菌的檢測(cè)具有良好的特異性.樓秀芹等[19]針對(duì)克羅諾桿菌ompA基因、16s rDNA和ITS序列進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，其結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)的結(jié)果相一致.Stoop等[20]首次提出針對(duì)克羅諾桿菌屬特異性很強(qiáng)的rpoB基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè).Huang等[21]通過克隆DNA促旋酶B亞基基因，構(gòu)建了僅能區(qū)別阪崎克羅諾桿菌和都柏林克羅諾桿菌的PCR檢測(cè)法.曲春波等[22]2013年首次利用編碼DNA促旋酶B亞基基因（拓?fù)洚悩?gòu)酶型Ⅱ）的gyrB看家基因，設(shè)計(jì)了特異性引物，靈敏度達(dá)到1.41 pg/PCR，建立了克羅諾桿菌PCR快速檢測(cè)方法.可見普通PCR檢測(cè)靶點(diǎn)包括16s rDN、ITS序列、ompA基因、rpoB基因和DNA促旋酶B亞基基因等.

2.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)定量PCR（又稱熒光定量PCR），是一種核酸定量技術(shù).在普通PCR檢測(cè)基礎(chǔ)上加入了熒光探針，把核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合在一起，依據(jù)熒光檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)弱來鑒定PCR產(chǎn)物，提高了檢測(cè)的靈敏度[23].

2005年Seo和Brackett[24]首次針對(duì)阪崎腸桿菌dnaG基因5'端和rpsU基因3'末端設(shè)計(jì)引物和Taq Man探針，構(gòu)建實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法.采用該體系鑒別克羅諾桿菌、腸桿菌和非腸桿菌科細(xì)菌，結(jié)果顯示此方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.6cfu/g.且檢測(cè)過程中省去平板接種和生化鑒定的時(shí)間，檢測(cè)效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法，作為FDA篩選和確認(rèn)嬰兒配方奶粉中克羅諾桿菌的官方方法之一.2012年Soler等[25]利用palF基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)多株克羅諾桿菌進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，準(zhǔn)確度達(dá)到100%，特異性強(qiáng)，未發(fā)現(xiàn)非克羅諾桿菌的菌株，且樣品的檢測(cè)限可達(dá)到1 cfu/10g，靈敏度高.Wang等[26]2012年利用MMS操縱子基因序列對(duì)67株菌株（包括4株克羅諾桿菌）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，檢出率為100%，靈敏度高，且不受高濃度沙門氏菌侵染的影響.采用此方法和ISO方法同時(shí)對(duì)92份食品樣品進(jìn)行羅諾桿菌檢測(cè)，其陽(yáng)性檢出率高于ISO方法.Dong等[27]和Hu等[28]分別針對(duì)ompA基因和cgcA基因設(shè)計(jì)探針引物，建立了比普通PCR靈敏度更高，特異性更強(qiáng)的檢測(cè)方法.近年來，也有許多關(guān)于多重?zé)晒舛縋CR用于鑒定克羅諾桿菌的報(bào)到.Li等[29]以16S rRNA和fusA基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，建立出能夠精確鑒別阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌的雙重?zé)晒舛縋CR方法，檢出限為102 cfu/mL.2016年Kaclíková和Oravcová利用dnaG基因建立了快速、準(zhǔn)確地從嬰幼兒配方奶粉產(chǎn)品中檢測(cè)耐熱性克羅諾桿菌的熒光定量PCR方法[30].

2.2.3 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

2000年Notomit等[31]建立了一種能在等溫條件下，短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法.該技術(shù)能特異、高敏、高效地?cái)U(kuò)增目標(biāo)基因，結(jié)果易判斷.

賀楠等[32]基于克羅諾桿菌16S rRNA基因設(shè)計(jì)LAMP引物，最低檢測(cè)限為0.3pg/DNA，靈敏度是普通PCR的1000倍.Liu等[33]和徐曉可等[34]探究了LAMP法和PCR法在克羅諾桿菌快速檢測(cè)中的差異性，研究結(jié)果一致表明LAMP法檢測(cè)的特異性和靈敏性明顯優(yōu)于PCR法.

馬寅眾等[35]對(duì)克羅諾桿菌16S rRNA基因及外膜蛋白A（ompA）基因設(shè)計(jì)LAMP引物進(jìn)行LAMP法檢測(cè)，ompA引物最低檢出限僅為16S rRNA引物的1/10.即以外膜蛋白A（ompA）基因設(shè)計(jì)LAMP引物靈敏度更高.

李靜等[36]在原有單引物環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上，以阪崎克羅諾桿菌ompA基因序列為靶序列，加入熒光染料，通過對(duì)熒光信號(hào)的分析，建立了一種操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、可實(shí)時(shí)監(jiān)控的實(shí)時(shí)熒光單引物等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的方法.李麗麗等[37]針對(duì)克羅諾桿菌16S rRNA設(shè)計(jì)3組LAMP引物，建立的克羅諾桿菌恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)法和傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果一致，時(shí)效性高.

2.2.4 免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法

免疫測(cè)定法（immunoassay，IA）是一種利用抗原和抗體特異性、可逆性為基礎(chǔ)的診斷方法，對(duì)細(xì)菌的鑒別研究，已有多半個(gè)世紀(jì)[38].現(xiàn)已建立的克羅諾桿菌免疫學(xué)檢測(cè)方法還不多.

2.2.4.1 免疫磁珠法（immunomagnetic separatio，MS）

免疫磁珠法是表面被抗體包被，進(jìn)行抗原抗體特異性反應(yīng).在強(qiáng)大的外加磁場(chǎng)中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)菌被滯留在磁場(chǎng)中，而其他沒有該種表面抗原的細(xì)菌不能與免疫磁珠相結(jié)合，從而達(dá)到分離的目的.這一技術(shù)目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用于細(xì)胞分離、微生物檢測(cè)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面也多有應(yīng)用.

朱英蓮等[39]利用免疫磁性殼聚糖微球檢測(cè)克羅諾桿菌，將氨基化修飾后的磁珠與克羅諾桿菌抗體進(jìn)行偶聯(lián)，捕獲并富集細(xì)菌.結(jié)果顯示該方法10.0min即可完成對(duì)克羅諾桿菌抗體的偶聯(lián)，捕獲率達(dá)94.7%，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法一致.說明免疫磁珠法是一種靶向特異性強(qiáng)、快速富集、分離克羅諾桿菌的有效方法.

Chen等[40]建立了一種免疫磁珠分離聯(lián)合熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（immunomagnetic separation polymerase chain reaction，IMS-PCR）快速檢測(cè)克羅諾桿菌的方法，該法以免疫磁珠富集細(xì)菌，同時(shí)基于細(xì)菌外膜蛋白A（ompA）基因設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，經(jīng)過8h富集后，檢出限從5.2×102cfu/mL降低至5.2×101cfu/mL.結(jié)果顯示IMS-PCR方法非常靈敏、快速、可靠.支援等[41]使用量子點(diǎn)熒光標(biāo)記和免疫磁性分離聯(lián)合應(yīng)用的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間僅為2h，靈敏度高，特異性好，可應(yīng)用于食品中的克羅桿菌檢測(cè).

2.2.4.2 脂質(zhì)體免疫檢測(cè)法（liposome immunoassay，LIA）

脂質(zhì)體（Liposome）是脂類在水相介質(zhì)中親水頭部插入水中，疏水尾部伸向空氣，自發(fā)形成的內(nèi)部中空外層是雙層磷脂分子的球形小體[42]，直徑約為25～1000nm.由于脂質(zhì)體表面能結(jié)合單克隆抗體或基因抗體，內(nèi)部水相可嵌合大量顯色劑，使得所形成的免疫脂質(zhì)體具有較高的靈敏度[43].

Song等[44]基于熒光脂質(zhì)體結(jié)合免疫兔獲得抗穆汀斯克羅諾桿菌Ig G，制備熒光標(biāo)記免疫脂質(zhì)體，捕獲穆汀斯克羅諾桿菌，裂解后，在激發(fā)波長(zhǎng)為550nm和發(fā)射波長(zhǎng)585nm下測(cè)定熒光信號(hào)，結(jié)果顯示此方法靈敏度為6.3×104cfu/mL，相比傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有快速、高效、低成本的優(yōu)點(diǎn).2016年Shukla等[45-46]人建立的阪崎克羅諾桿菌脂質(zhì)體免疫檢測(cè)法靈敏度高于間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附，且與克羅諾桿菌其他菌屬，以及其他非克羅諾桿菌無交叉反應(yīng).

2.2.4.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附法同樣以抗體和抗原的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，和其他免疫方法區(qū)別在于其以酶或者輔酶標(biāo)記抗原或者抗體，將抗原抗體的特異性與酶促反應(yīng)的敏感性相結(jié)合，提高檢測(cè)的靈敏性[47-48].采用ELISA技術(shù)，食品未經(jīng)分離提取，即可進(jìn)行定性和定量分析，顯著提高了檢出效率.目前，ELISA常用的方法有直接法、間接法、雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法等，該技術(shù)由于靈敏度高、特異性強(qiáng)、攜帶方便、易于商品化和經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，在食品分析檢測(cè)方面前景廣闊.

宋春美等[49]和周鶴峰等[50]，建立雙抗夾心法檢測(cè)克羅諾桿菌，分別在6h和2h內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，檢出限均約在104cfu/mL，對(duì)其他食品中常見致病菌的檢測(cè)均呈陰性，無交叉反應(yīng)靈敏度高.

Park等[51]2012建立了一種可在24h內(nèi)針對(duì)穆汀斯克羅諾桿菌的雙抗夾心ELISA檢測(cè)法，該法最低檢出限為6.3×104cfu/mL，檢測(cè)靈敏度高，與克羅諾桿菌其他菌屬及其它常見致病菌間無交叉反應(yīng).Song等[52]利用間接非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法建立了一種可同時(shí)檢測(cè)7種克羅諾桿菌的快速檢測(cè)方法，嬰幼兒奶粉中含克羅諾桿菌細(xì)胞數(shù)在10個(gè)以下的樣品，利用該方法可在36h內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，顯示出極高的靈敏性和特異性.

2.2.4.4 電化學(xué)免疫傳感器（Electrochemical? Immunosensor）

電化學(xué)免疫傳感器是將電化學(xué)傳感與免疫分析技術(shù)相結(jié)合而構(gòu)建的一類新型生物傳感器，應(yīng)用于痕量免疫原性物質(zhì)的分析研究，因其特異性高、快速、穩(wěn)定性強(qiáng)、造價(jià)低且操作程序簡(jiǎn)易，在食品安全領(lǐng)域已有較多的研究和初步應(yīng)用[53].

張曉等[54]依次將生物染料硫堇、辣根過氧化物酶標(biāo)記的克羅諾阪崎腸桿菌抗體固定在用多壁碳納米管/十二烷基苯磺酸鈉修飾的四通道絲網(wǎng)印刷電極上，制成電化學(xué)免疫傳感器.該方法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的線性范圍為102-108cfu/mL，檢出限為5.7×101cfu/mL，靈敏度很高，同時(shí)表現(xiàn)出較好的特異性和重現(xiàn)性（RSD=6.3%）.Shukla等[55]2018年使用氧化石墨烯納米金離子復(fù)合物建立免疫傳感器用于快速檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌.每個(gè)樣品的分析時(shí)間只需要15min，無須任何富集或預(yù)富集，線性范圍為2.0×102-2.0×107cfu/mL，檢出限為2.0×101cfu/mL.與其他類型的克羅諾桿菌相比，此方法對(duì)阪崎克羅諾桿菌具有良好的選擇性、再現(xiàn)性和反應(yīng)性.表明其在阪崎克羅諾桿菌臨床診斷中的具有潛在應(yīng)用價(jià)值.

3 展望

克羅諾桿菌能引起新生兒致命傷害，而受到世界多國(guó)的高度關(guān)注，因此建立相關(guān)的有效檢測(cè)方法極為重要.目前已逐步建立了克羅諾桿菌的傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)、分子層面和免疫等層面的檢測(cè)方法，其中傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)不需要特殊的設(shè)備和技能，是食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)選用的方法，也是各個(gè)質(zhì)檢部門的首選方法，缺點(diǎn)是耗時(shí)、費(fèi)力;為適應(yīng)食源性致病菌的快速檢測(cè)，分子檢測(cè)和免疫檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生，分子檢測(cè)方法靈敏度高、時(shí)效性好，且引物的擴(kuò)增是在完全封閉狀態(tài)下進(jìn)行，避免了產(chǎn)物的污染，但分子層面的檢測(cè)依賴基因的特異性，尋找特異性顯著、可靠的基因片段，是以后的發(fā)展方向;抗體層面的檢測(cè)基于抗原和抗體特異性結(jié)合，靶向特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)單、快速，成為近些年的研究熱點(diǎn).

綜上所述，建立特異性好、敏感度高、簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、重現(xiàn)性高的克羅諾桿菌檢測(cè)方法有待于進(jìn)一步的研究.隨著克羅諾桿菌屬菌株基因數(shù)據(jù)庫(kù)的完善，免疫傳感器的性能的改善以及免疫檢測(cè)手段的改進(jìn)，分子層面、抗體層面及電化學(xué)相結(jié)合的檢測(cè)方法將成為克羅諾桿菌檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì).

參考文獻(xiàn)：

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