轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)及其在植物系統(tǒng)學(xué)上的研究進(jìn)展

蔣費(fèi)濤 王書平 祁俊生 熊春霞

摘 要：轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要分支，可以從整體水平上反映細(xì)胞或者組織中基因的表達(dá)情況及其調(diào)控規(guī)律，已經(jīng)被應(yīng)用到各個(gè)研究領(lǐng)域。主要簡(jiǎn)述了轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)在植物系統(tǒng)學(xué)中的應(yīng)用，最后展望了轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在植物系統(tǒng)學(xué)中的研究前景。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄組學(xué)；植物分類學(xué)；分子標(biāo)記

基金項(xiàng)目：“重要跨境農(nóng)業(yè)入侵生物精準(zhǔn)識(shí)別與智能化快速檢測(cè)”（2017YFC1200602）

系統(tǒng)學(xué)這一詞最早出現(xiàn)在林奈的書籍中，隨后在Smith和Nutall等人的著作中，系統(tǒng)植物學(xué)（Systematics Botany）作為一門學(xué)科被提出，系統(tǒng)學(xué)最初的含義是將命名的生物按照某個(gè)鑒別性狀或順序排列起來。Simpson Michael G.在他編寫的《植物系統(tǒng)學(xué)（Plants Systematic）》一書中將系統(tǒng)學(xué)定義為“包括并涵蓋傳統(tǒng)分類學(xué)、描述、識(shí)別、命名和生物分類，其首要的目標(biāo)是重建系統(tǒng)發(fā)育和生命進(jìn)化史”[1]。

植物系統(tǒng)學(xué)既是植物學(xué)的基礎(chǔ)，同時(shí)，也是生態(tài)學(xué)等全部生命科學(xué)的基礎(chǔ)，對(duì)植物系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行研究有著至關(guān)重要的意義。首先，對(duì)植物系統(tǒng)學(xué)的研究可以提供生命巨大的多樣性信息，可以讓人們充分地了解植物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和生命發(fā)展史，而對(duì)生命發(fā)展史的充分了解不僅可以洞察其他領(lǐng)域，還具有實(shí)用價(jià)值。其次，系統(tǒng)學(xué)的研究為劃分物種和種下分類（亞種和變種）提供了科學(xué)依據(jù)，并為確定種間區(qū)別提供了科學(xué)依據(jù)，這類研究在保護(hù)生物學(xué)的今天尤為重要，了解種類分類群的界限，可以更明確地對(duì)稀有或?yàn)l危的物種加以保護(hù)和保存。植物系統(tǒng)學(xué)是記錄生物多樣性的主要工具，也是幫助拯救生物多樣性的重要工具[1]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為功能基因組學(xué)的代表，利用高通量測(cè)序開發(fā)分子標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)明顯，由于不需要物種的選擇性、測(cè)序靈敏度高，特別是對(duì)于尚未公布基因組測(cè)序的新物種，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠快速高效地呈現(xiàn)出覆蓋面廣、準(zhǔn)確度高的信息，成為開發(fā)分子標(biāo)記的良好工具而被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳育種、種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)等領(lǐng)域，從分子的層面研究物種的演化和系統(tǒng)的分類[2]。本研究就目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)在植物分類中的應(yīng)用情況作介紹。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

1.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述

20世紀(jì)90年代以來，越來越多的基因組序列被測(cè)定，后基因組學(xué)時(shí)代到來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Transcriptomics）、基因組學(xué)（Genomics）、代謝組學(xué)（Metabolomics）和蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）等組學(xué)技術(shù)得到了迅速的發(fā)展與廣泛的應(yīng)用[3]。其中以轉(zhuǎn)錄過程作為研究對(duì)象的轉(zhuǎn)錄組學(xué)是最先發(fā)展且應(yīng)用最廣的組學(xué)技術(shù)[4]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。轉(zhuǎn)錄組通常是狹義上的轉(zhuǎn)錄組，指細(xì)胞中所有參與蛋白質(zhì)翻譯的信使RNA（mRNA）的總和[5]。研究整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的第一次嘗試開始于20世紀(jì)90年代初，轉(zhuǎn)錄組（Transcriptome）這個(gè)術(shù)語是C. Auffray于1996年最先提出來的，用來描述整套轉(zhuǎn)錄本的特征。隨后在1997年，VECLALESUC在研究釀酒酵母細(xì)胞時(shí)提出并在科學(xué)論文中第一次使用[6]。

自20世紀(jì)90年代初開始嘗試研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)后，到20世紀(jì)90年代末，科學(xué)技術(shù)的快速進(jìn)步與發(fā)展使轉(zhuǎn)錄組學(xué)成了一門被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的科學(xué)[7]。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)主要分為兩類：一類是在20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的基于雜交方法的微陣列技術(shù)（Microarray），另一類是在2000年發(fā)展起來的基于測(cè)序的方法，主要包括表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)（Expressed Sequence Tag，EST）、基因表達(dá)序列分析技術(shù)（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）、大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)（Massively Parallel SignatureSequencing，MPSS）以及高通量直接全轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序技術(shù)（RNA Sequencing，RNA-seq）等[8]。

其中，較早發(fā)展起來的技術(shù)是Microarray以及EST技術(shù)，隨著近幾年的快速發(fā)展，RNA-seq逐漸成了基因表達(dá)分析的首選技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄應(yīng)用和微陣列的替代等方面都取得了極其重大的進(jìn)展[9]。

1.2 微陣列技術(shù)

20世紀(jì)90年代，微陣列技術(shù)逐漸發(fā)展起來，其通過與一系列互補(bǔ)探針的雜交來測(cè)量一組已確定的轉(zhuǎn)錄組的豐度，最早發(fā)表于1995年[10]。微陣列技術(shù)的原理是將短核苷酸寡聚體構(gòu)成的探針分子固定在玻璃等支持物上，然后與已經(jīng)被標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，對(duì)雜交的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)和分析后，就可以得到樣品分子的數(shù)量和樣品分子的基因表達(dá)信息。隨著科技的發(fā)展，微陣列設(shè)計(jì)和制造的進(jìn)步提高了探針的特異性，并允許更多基因在單個(gè)陣列上進(jìn)行檢測(cè)。與此同時(shí)，熒光檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展提高了低豐度轉(zhuǎn)錄組的靈敏度和測(cè)量精度。用于轉(zhuǎn)錄分析的微陣列通常分為兩類，一類是低密度斑點(diǎn)陣列，另一類是高密度短探針陣列[11]。直到2000年末，高密度微陣列都是轉(zhuǎn)錄分析首先選擇的方法[12]。

1.3 表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)

20世紀(jì)80年代，低通量Sanger測(cè)序開始被用來對(duì)cDNA庫中的隨機(jī)單個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序，稱為表達(dá)序列標(biāo)簽。表達(dá)序列標(biāo)簽是由單個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄體產(chǎn)生的核苷酸短序列[13]。20世紀(jì)80年代早期，人們認(rèn)識(shí)到來自cDNA的短片段可以用于鑒定基因后開始研究EST技術(shù)?；蜓芯克═he Institute for Genomic Research，TIGR）的科學(xué)家是最早大規(guī)模生成EST數(shù)據(jù)的科學(xué)家。

表達(dá)序列標(biāo)簽是隨機(jī)挑選cDNA文庫，通過單向測(cè)序獲得的部分序列信息來代表完整cDNA序列的一種技術(shù)方法，EST序列的長(zhǎng)度通常小于1 000 bp。通過對(duì)生物體EST 的分析，可以獲得生物體內(nèi)基因的表達(dá)情況和表達(dá)豐度[14]。使用EST技術(shù)時(shí)可以不需要了解它們來自于具體哪些有機(jī)體，對(duì)非模型生物具有吸引力[15]。表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)目前已經(jīng)被應(yīng)用在發(fā)現(xiàn)和分離新的基因、繪制遺傳學(xué)圖譜等領(lǐng)域[14]。

1.4 基因表達(dá)系列分析

1995年，最早的基于測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法之一—SAGE被開發(fā)出來，它是由Sanger對(duì)連接的隨機(jī)轉(zhuǎn)錄片段進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果。SAGE是EST方法的一種發(fā)展，因?yàn)镋ST方法通量低、價(jià)格昂貴且一般無法定量，SAGE就是為了克服這些限制而發(fā)展起來的。SAGE目的是提高標(biāo)記的吞吐量，并能夠?qū)D(zhuǎn)錄的豐度進(jìn)行量化[16]。

SAGE技術(shù)的原理是將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用限制性內(nèi)切酶將cDNA切割為11 bp的片段，然后將cDNA片段連接成長(zhǎng)度大于500 bp的長(zhǎng)鏈，利用低通量長(zhǎng)讀數(shù)的方法測(cè)序，然后根據(jù)特定序列標(biāo)簽出現(xiàn)的次數(shù)估計(jì)基因表達(dá)的豐度。SAGE技術(shù)在疾病、發(fā)育、細(xì)胞凋亡等多個(gè)領(lǐng)域已被廣泛地應(yīng)用，但在植物方面的研究相對(duì)較少[17-18]。

1.5 RNA測(cè)序

RNA-seq是利用深度測(cè)序技術(shù)來對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行分析的一種方法。與那些以雜交為原理的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相比，以測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的技術(shù)可以直接測(cè)定cDNA序列。RNA-seq通過使用高通量測(cè)序方法，再結(jié)合一些計(jì)算方法來達(dá)到捕獲和量化提取物中轉(zhuǎn)錄本的目的，所產(chǎn)生的核苷酸序列長(zhǎng)度根據(jù)所使用測(cè)序方法的不同而不同，一般在30～1 000 bp。RNA測(cè)序技術(shù)自2006年被提出后，發(fā)展得非常迅速并且被廣泛使用，2015年取代微陣列成為主要的轉(zhuǎn)錄技術(shù)[19]。

RNA-seq主要以第二代測(cè)序平臺(tái)為基礎(chǔ)，擁有一整套全新且完備的建庫、測(cè)序以及分析體系[20]。目前，用于RNAseq的高通量測(cè)序平臺(tái)可從4家公司獲得，分別是Illumina，Roche 454，Helicos BioScience和Life Technologies[21]。

RNA-seq雖然是一項(xiàng)正在開發(fā)的技術(shù)，但與其他的現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)勢(shì)仍然比較明顯。與基于雜交方法的微陣列技術(shù)相比，RNA-seq不能局限于檢測(cè)與現(xiàn)有基因組序列相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本，RNA-seq對(duì)于尚未確定基因組序列的生物特別有吸引力；微陣列技術(shù)在應(yīng)用于低水平或者高水平表達(dá)的基因時(shí)敏感性比較低，同時(shí)，RNA-seq也具有很大的動(dòng)態(tài)范圍，RNA-seq的典型動(dòng)態(tài)范圍約為5個(gè)數(shù)量級(jí)。RNA-seq的輸入RNA量也遠(yuǎn)低于微陣列技術(shù)，在表達(dá)水平方面，RNA-seq被證明是非常準(zhǔn)確的，其結(jié)果也顯示了高水平的重復(fù)性且使用的成本要低于Sanger測(cè)序等[22-24]。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在植物分類研究中的應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在物種鑒定上的研究

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，利用RNA-seq開發(fā)EST-SSR標(biāo)記，逐漸成為一種低成本、高效率的技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)在中藥偽品鑒定、植物品種鑒定方面有廣泛的應(yīng)用[25]。

蔣超等[26]對(duì)忍冬與其變種的ESTs序列進(jìn)行了分析，選出15對(duì)引物對(duì)52份金銀花進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中3對(duì)引物可以準(zhǔn)確鑒別金銀花的原植物忍冬。馬慶華等[27]開發(fā)12對(duì)EST-SSR引物對(duì)平歐雜種榛進(jìn)行品種鑒定，其中 CAF-2、CAF-3、CAF-12和CAF-13等4對(duì)引物的組合使用，可區(qū)分43個(gè)平歐雜種榛品種，CAF-2、CAF-13等2對(duì)引物可區(qū)分主栽的16個(gè)品系，為平歐雜種榛的鑒定提供了快捷且有效的方式。這表明EST-SSR 標(biāo)記法應(yīng)用于物種的鑒別具有較好的可行性。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在種質(zhì)資源上的研究與應(yīng)用

種質(zhì)資源是生物體遺傳給子代的遺傳物質(zhì)，可以保證生命延續(xù)和種族繁衍，種質(zhì)資源是作物遺傳改良和相關(guān)研究的基礎(chǔ)，擁有種質(zhì)資源的數(shù)量和質(zhì)量，直接影響種質(zhì)資源的利用效率和現(xiàn)代種業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[28]。

龍蕩等[29]對(duì)早實(shí)枳進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本測(cè)序，共設(shè)計(jì)SSR引物29對(duì)，對(duì)18份來自蕓香科柑橘3大屬的不同品種進(jìn)行研究，將18份材料成功聚類到3個(gè)群體，并開發(fā)選擇出9對(duì)多態(tài)性好的引物對(duì)早實(shí)枳種質(zhì)資源進(jìn)行監(jiān)督，鑒定出15份不同程度的變異植株。龍妮等[30]對(duì)6種野生煙草種和西紅柿的蛋白質(zhì)組進(jìn)行基因家族分析，識(shí)別出2 491個(gè)單拷貝基因家族，從轉(zhuǎn)錄組水平上解釋了野生煙草在進(jìn)化上的位置。同時(shí)，研究了野生煙草種的抗性基因及煙堿轉(zhuǎn)錄基因，對(duì)今后煙草和茄科物種抗病性品種的育種具有指導(dǎo)意義。這些轉(zhuǎn)錄組序列豐富了煙屬野生種生物的信息數(shù)據(jù)，為今后煙草分子標(biāo)記開發(fā)、重要形狀相關(guān)基因克隆及功能分析等研究奠定了基礎(chǔ)。

2.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在遺傳多樣性上的研究與應(yīng)用

遺傳多樣性不僅是生物多樣性的基礎(chǔ)，同時(shí)顯示著基因的多樣性，在分子層面對(duì)遺傳多樣性進(jìn)行研究可以揭示差異的本質(zhì)[31]。

孫圣[31]基于SSR標(biāo)記對(duì)瀕危植物血皮槭11個(gè)群體288個(gè)樣本的天然群體遺傳變異的研究，結(jié)果說明血皮槭具有較高的遺傳多樣性，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)血皮槭自然分布區(qū)內(nèi)中心群體的遺傳多樣性要高于周圍群體遺傳多樣性，綜合分析認(rèn)為血皮槭的遺傳多樣性不是導(dǎo)致其瀕危的主要原因。張?zhí)鸬萚32]基于Illumina HISeq 2 000對(duì)核桃的4種組織（葉、芽、雌花、雄花）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行特征分析，開發(fā)EST-SSR引物，隨機(jī)挑選78對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，其中53對(duì)有條帶，39對(duì)具有多態(tài)性。利用這些引物對(duì)來自88個(gè)核桃的個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明不同地理群體的核桃具有其特有的遺傳性狀，且88個(gè)個(gè)體遺傳多樣性都很高。

2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在植物系統(tǒng)分類中的應(yīng)用

邢俊連等[33]利用皂莢轉(zhuǎn)錄組與基因組數(shù)據(jù)對(duì)皂莢屬在豆科植物中的系統(tǒng)進(jìn)化位置進(jìn)行研究，通過使用直系同源對(duì)建立物種系統(tǒng)進(jìn)化樹的方法，對(duì)皂莢在豆科中的進(jìn)化位置進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類定位一致。同時(shí)，利用皂莢屬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR引物，為今后品種鑒定、遺傳多樣性分析以及皂莢遺傳資源評(píng)價(jià)提供了分子手段。李清瑩等[34]對(duì)火力楠的10個(gè)天然群體進(jìn)行EST-SSR分子標(biāo)記研究，對(duì)火力楠進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)并篩選出火力楠EST-SSR引物12對(duì)，利用這些引物將火力楠的10個(gè)天然群體分為兩大類群4個(gè)亞類群。

3 問題與展望

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)在研究植物系統(tǒng)分類、物種鑒定以及遺傳多樣性分析等方面均取得了一定的進(jìn)展，在植物系統(tǒng)學(xué)的研究及內(nèi)部系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中發(fā)揮著不可或缺的作用。目前，尋找準(zhǔn)確且快速鑒定和測(cè)試植物種類的技術(shù)逐漸成為很多國(guó)家的目標(biāo)，很多研究表明EST-SSR標(biāo)記應(yīng)用于植物品種鑒定是可行的[35]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為植物系統(tǒng)學(xué)研究提供了新的技術(shù)手段，使植物的轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)入到一個(gè)快速發(fā)展的階段。但在實(shí)際應(yīng)用中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究也面臨著一些問題，比如如何高效地挖掘功能基因。隨著生物信息學(xué)軟件的不斷開發(fā)與完善，蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等多組學(xué)時(shí)代到來，在進(jìn)行植物系統(tǒng)學(xué)的研究時(shí)，有必要將轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)與其他組學(xué)技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，合理分析，提供更科學(xué)和準(zhǔn)確的結(jié)果。

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Research progress of transcriptional technology and its advances in plant phylogeny

Jiang Feitao1， Wang Shuping2， Qi Junsheng1， Xiong Chunxia1（1.Chongqing Three Gorges University， Chongqing 050024， China； 2.Animal， Plant and Food Inspection and Quarantine Technology Center of Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shanghai 200000， China）

Abstract：As an important branch of systems biology， transcriptomics can reflect the expression of genes and their regulation in cells or tissues from the overall level， and has been applied to various research fields. The application of transcriptomics and transcriptomics in plant phylogeny is briefly described in this paper. Finally， the prospect of transcriptomics in plant phylogeny is prospected.

Key words：transcriptomics； plant taxonomy； molecular markers