轉(zhuǎn)TaCOMT-3D基因小麥的農(nóng)藝性狀評價

周淼平 張增艷 姚金保 王化敦 楊學明 張鵬 余桂紅 馬鴻翔

摘要?TaCOMT-3D基因是小麥木質(zhì)素合成的關鍵基因，也是小麥抵御紋枯病菌侵染的重要基因。為了評估轉(zhuǎn)基因小麥中TaCOMT-3D基因組成型表達對農(nóng)藝性狀的影響，4個遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系及其受體對照揚麥16用于TaCOMT-3D基因檢測、不同器官表達分析驗證、紋枯病抗性鑒定、小區(qū)產(chǎn)量試驗以及主要農(nóng)藝性狀的考察。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系均能檢測到導入的TaCOMT-3D基因并且該基因能組成型表達;轉(zhuǎn)基因株系與受體對照揚麥16相比，紋枯病抗性顯著提高;除了部分轉(zhuǎn)基因株系的主穗穗長、主穗粒數(shù)、籽粒蛋白含量與受體對照差異顯著外，轉(zhuǎn)基因小麥的生育期、、株高、產(chǎn)量性狀、主穗性狀和籽粒性狀與受體對照均沒有顯著差異。試驗結(jié)果表明，TaCOMT-3D基因的組成型表達對轉(zhuǎn)基因小麥的主要農(nóng)藝性狀影響不明顯。

關鍵詞?小麥;TaCOMT-3D;轉(zhuǎn)基因;紋枯病;農(nóng)藝性狀

中圖分類號?S?503.2文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）01-0102-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.032

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Evaluation of Agronomic Traits of Transgenic Wheat with TaCOMT-3D

ZHOU Miao?ping1，ZHANG Zeng?yan2，YAO Jin?bao1 et al

（1.Institute of Grain Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing，Jiangsu 210014;2.Institute of Crop Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Abstract?TaCOMT?3D gene is a key gene in wheat lignin synthesis and is also an important gene resistant to wheat sharp eyespot.To assess the effect on agronomic traits of the transgenic wheat by TaCOMT?3D，four varieties with stable heredity and their receptor Yangmai 16 were used to detect the TaCOMT?3D ，analyze the expression of the gene in different organs，evaluate the resistance to wheat sharp eyespot，test plot yield and survey the major agronomic traits.The results showed that the TaCOMT?3D gene could be detected in all transgenic lines and expressed constitutively in different organs.Compared with Yangmai 16，the resistance to wheat sharp eyespot improved significantly in all transgenic lines.There were no significant differences in wheat growth period，plant height，yield traits，main spike traits and grain traits except for significant differences in grain protein content，ear length and number of grains of main spike between some transgenic lines and receptor control.The results indicated that the constitutive expression of TaCOMT?3D had no significant effect on the main agronomic traits of transgenic wheat.

Key words?Wheat; TaCOMT?3D;Transgene;Wheat sharp eyespot;Agronomic trait

小麥紋枯病是我國長江中下游麥區(qū)和黃淮麥區(qū)的重要病害，每年造成經(jīng)濟損失巨大[1]，該病害主要由禾谷絲核菌等侵染小麥莖稈基部引起，抗病小麥的培育和推廣是防治該病害、保證小麥可持續(xù)發(fā)展的重要措施。由于小麥對紋枯病的抗性是數(shù)量性狀，抗性涉及多個QTL位點和多條染色體[2]，抗性QTL的累積耗時費力，因而小麥抗紋枯病育種進展緩慢。

轉(zhuǎn)基因技術可以引進外源的抗病基因或者對小麥本身的基因進行修飾，從而提高小麥的紋枯病抗性，已經(jīng)成為小麥紋枯病抗病新種質(zhì)創(chuàng)制的重要途徑[3-5]。中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所張增艷實驗室對紋枯病抗感小麥品種CI12633（抗）和溫麥6號（感）采用基因芯片分析技術發(fā)現(xiàn)并克隆了位于3DL染色體的差異表達基因TaCOMT-3D，過表達和抑制表達試驗表明該基因是小麥抗紋枯病的重要基因，進一步的研究發(fā)現(xiàn)該基因的過表達增加了小麥莖稈中的木質(zhì)素積累，提高了莖稈強度，增強了對小麥紋枯病菌的抵御能力[6]。將由ubiquitin組成型啟動子驅(qū)動的TaCOMT-3D基因?qū)胄←溒贩N揚麥16中，發(fā)現(xiàn)其紋枯病抗性較受體對照明顯提高。但該基因的組成型表達對小麥其他農(nóng)藝性狀有何影響尚不明了。該研究擬對篩選獲得的4個遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系在大田環(huán)境下與受體對照揚麥16的農(nóng)藝性狀進行比較，評價TaCOMT-3D基因的組成型表達對轉(zhuǎn)基因株系重要農(nóng)藝性狀的影響。

1?材料與方法

1.1?材料?轉(zhuǎn)TaCOMT-3D基因株系CT248、CT274、CT323和CT345由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所張增艷研究員提供;受體對照揚麥16由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所麥類作物研究室提供。

1.2?方法

1.2.1?轉(zhuǎn)基因株系TaCOMT-3D基因的檢測。

分別取轉(zhuǎn)基因株系和對照揚麥16的幼苗葉片，冷凍干燥，全自動樣品快速研磨儀（上海凈信）磨碎后參照Karroten植物基因組DNA提取試劑盒操作手冊提取DNA。導入的TaCOMT-3D基因采用嵌合引物進行擴增，正向引物序列為TaOMT-3D-964JCF：5′—GAGAGGTACGAGAGGGAGTT—3′，反向引物序列為TaOMT-3D-1281JCR：5′—TAAATGTATAATTGCGGGAC—3′;PCR反應體系總體積為20 μL，含2× premix Taq （TaKaRa）10 μL，5 μmol/L 引物各 1 μL，50 ng 模板DNA。 PCR擴增條件為94 ℃ 預變性5 min;94 ℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物300 bp左右，PCR產(chǎn)物采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.2.2?轉(zhuǎn)基因株系TaCOMT-3D基因的表達分析。

灌漿期，取轉(zhuǎn)基因株系和對照的根、莖、葉和籽粒，液氮冷凍磨碎，采用植物RNA快速提取試劑盒（南京鐘鼎）提取RNA，Prime Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）進行反轉(zhuǎn)錄，按照SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa）推薦方法進行熒光定量PCR。Actin基因為內(nèi)參基因，其特異引物對為TaActin-F： 5′—CACTGGAATGGTCAAGGCTG—3′和TaActin-R：5′—CTCCATGTCATCCCAGTTG—3′; TaCOMT-3D基因特異引物對為TaCOMT-Q-F：5′—ATGTTCCAGAAGGTGCCC—3′和TaCOMT-Q-R：5′— TGCTCG TCGCTCCAGTC—3′。 熒光定量PCR在LineGene K 熒光定量PCR儀（杭州博日）上進行，擴增曲線：95 ℃ 30 s，循環(huán)1次;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)40次，72 ℃單點檢測信號。溶解曲線：95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s，連續(xù)檢測信號[7]。采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析。

1.2.3?轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀觀察和分析。

轉(zhuǎn)基因株系和受體對照于2018年12月17日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院六合轉(zhuǎn)基因基地按隨機小區(qū)播種，每個小區(qū)5行，行長2 m，行距0.25 m，3次重復。播種后覆蓋地膜至2019年1月15日，其余按正常小麥種植管理。

田間試驗主要對轉(zhuǎn)基因株系的生長發(fā)育和形態(tài)特征等主要農(nóng)藝性狀進行觀察，記載播種、出苗、抽穗、開花和成熟等各生育時期;調(diào)查和測量基本苗、高峰苗、有效穗、產(chǎn)量、株高等重要農(nóng)藝性狀;成熟時，考察主穗穗長、小穗數(shù)、不孕小穗數(shù)以及每穗粒數(shù);收獲后，測量籽粒大小、千粒重和籽粒蛋白含量等籽粒性狀;同時調(diào)查轉(zhuǎn)基因株系對白粉病、紋枯病和赤霉病等病害的抗性。

籽粒大小測量方法：每小區(qū)隨機取100粒籽粒，照相后采用SmartGrain軟件[8]根據(jù)像素計算籽粒長度與寬度;籽粒蛋白含量采用Perten DA7200近紅外儀測定。

所有數(shù)據(jù)的方差分析和t測驗分析均采用Excel 2016軟件進行，先進行方差分析，差異顯著的性狀再分別在各轉(zhuǎn)基因株系和受體對照間進行t測驗。

2?結(jié)果與分析

2.1?轉(zhuǎn)基因株系TaCOMT-3D基因的檢測結(jié)果

種植的4個轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)T3檢測已經(jīng)純合，該試驗已達T4代，拔節(jié)期分別取轉(zhuǎn)基因株系和受體對照揚麥16的葉片，提取DNA?？紤]到小麥本身含有TaCOMT-3D基因，因而采用嵌合引物檢測導入的TaCOMT-3D基因，嵌合引物的正向引物在TaCOMT-3D中，反向引物在nos終止子中，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系均能擴增出300 bp的目的條帶（圖1），而受體對照未有擴增條帶出現(xiàn)，表明導入的TaCOMT-3D基因已經(jīng)整合進小麥基因組并能穩(wěn)定遺傳。

2.2?轉(zhuǎn)基因株系TaCOMT-3D基因的表達分析結(jié)果

灌漿期分別取轉(zhuǎn)基因株系和受體對照的根、莖、葉片和籽粒樣品，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用熒光定量PCR檢測TaCOMT-3D基因的表達，以受體對照揚麥16各器官的表達為基準，計算轉(zhuǎn)基因株系不同器官的相對表達量，發(fā)現(xiàn)4個轉(zhuǎn)基因株系的根、莖、葉片和籽粒等器官中TaCOMT-3D基因的表達均超過受體對照揚麥16，符合組成型表達的預期。

2.3?轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

2.3.1?生育期的比較。由于播種已經(jīng)遲于揚麥16最適播種期，采用加大播種量和覆蓋地膜等措施，保證小麥齊苗和足苗。小麥返青后，加強肥水管理，小麥生長基本正常，轉(zhuǎn)基因株系生育期與受體親本揚麥16相仿（表1），表明目的基因的導入和持續(xù)表達對其生育期影響不明顯。

2.3.2?苗情和產(chǎn)量的比較。4個轉(zhuǎn)基因株系與揚麥16相似，均屬春性小麥，幼苗半直立，后期株型較松散。由于播種氣溫偏低，盡管采取加大播種量和地膜覆蓋措施，但是基本苗仍偏低，轉(zhuǎn)基因株系與對照沒有明顯差別，表明目的基因的導入和表達對種子萌發(fā)沒有顯著影響。

在基本苗基本一致的情況下，轉(zhuǎn)基因株系的高峰苗和有效穗與對照差異不顯著，說明目的基因的表達沒有對小麥的繁茂性和成穗率產(chǎn)生明顯影響。除了轉(zhuǎn)基因株系CT323較揚麥16增產(chǎn)外，其余3個轉(zhuǎn)基因株系的產(chǎn)量低于揚麥16，但都未達到顯著差異水平。由于播種期的推遲，生育期縮短，轉(zhuǎn)基因株系和對照的株高均有所降低，但轉(zhuǎn)基因株系與對照株高相差不明顯（表2）。

2.3.3?主穗性狀的比較。

灌漿后期，對轉(zhuǎn)基因株系和對照的主穗農(nóng)藝性狀進行考察，結(jié)果見表3，除了CT274的主穗粒數(shù)、CT345的主穗長度和主穗粒數(shù)與對照相比有顯著差異外，其余轉(zhuǎn)基因株系主穗性狀與對照揚麥16相比無顯著差異。

2.3.4?籽粒性狀的比較。籽粒收獲曬干后，每小區(qū)隨機取100粒測定籽粒長度和寬度，計算平均值，方差分析顯示盡管轉(zhuǎn)基因株系和對照的籽粒長寬有所變化，但差異均不顯著。采用近紅外測定籽粒蛋白含量發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系籽粒蛋白含量均較對照有所提高，CT274和CT345與對照的差異達到顯著水平。轉(zhuǎn)基因株系的千粒重與對照差異不顯著（表4）。

2.4?病害抗性的比較

由于2018—2019年度小麥生長期雨水偏少，田間濕度低，并且試驗地已經(jīng)多年未種植小麥，與常規(guī)小麥的物理距離也超過500 m，小麥病害的病原菌較少，因而轉(zhuǎn)基因株系和對照揚麥16的白粉病、銹病、紋枯病、赤霉病、小麥黃花葉病等主要病害均未發(fā)生或輕微發(fā)生，轉(zhuǎn)基因株系與受體對照差異不明顯。但在人工病麥粒接種條件下，轉(zhuǎn)基因株系與對照紋枯病病害差異仍然明顯（表5），轉(zhuǎn)基因株系較受體對照平均病情指數(shù)降低18.6%～34.6%。

3?討論與結(jié)論

木質(zhì)素是細胞次生壁的主要成分，在植物體內(nèi)的含量僅次于纖維素，對維管植物的生長發(fā)育是必需的，它參與了細胞壁木質(zhì)化，加大了細胞壁的抗壓強度，促進了機械組織的形成，對植物的抗倒伏和抗病有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素由木質(zhì)素單體聚合而成，根據(jù)單體來源的不同可將木質(zhì)素分為H型木質(zhì)素、G型木質(zhì)素和S型木質(zhì)素3種類型，單子葉植物均含有這3種木質(zhì)素。

咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（COMT）是植物木質(zhì)素合成的重要基因，COMT可以催化咖啡酸、5-羥基松柏醛、5-羥基松柏醇甲基，分別形成阿魏酸、芥子醛和芥子醇，從而調(diào)控S型木質(zhì)素的合成[9]。研究發(fā)現(xiàn)，S型木質(zhì)素含量與擬南芥對核盤菌和維管束真菌甘藍輪枝菌的感病性有關[10]。玉米中研究也發(fā)現(xiàn)，ZmCCoAOMT2可以調(diào)節(jié)木質(zhì)素含量以及改變次生代謝途徑調(diào)節(jié)細胞的死亡程序從而提高對玉米小斑病和灰色葉斑病的抗性[11]。但將這些基因?qū)胫参镏薪M成型表達對植物其他性狀影響的研究幾乎沒有報道。

中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所張增艷課題組將組成型表達的TaCOMT-3D基因?qū)胄←溈梢蕴岣咔o稈木質(zhì)素含量，增強小麥莖稈強度，提高對紋枯病菌侵染的抵御能力。筆者引進純合的轉(zhuǎn)基因株系與受體對照在大田生長狀況下評估組成型表達的TaCOMT-3D基因?qū)π←溒渌r(nóng)藝性狀的影響，結(jié)果表明只有個別轉(zhuǎn)基因株系在主穗穗長、主穗粒數(shù)和籽粒蛋白含量方面與受體對照的差異達0.05顯著水平，但該基因?qū)Χ盒?、生育期、產(chǎn)量和株高等重要農(nóng)藝性狀沒有產(chǎn)生顯著影響。

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