一株豬鏈球菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

鄭成坤 賈夢蝶 王彥紅

摘要?為了確定揚州市某豬場發(fā)病豬的病原，對該豬場送檢的病豬心臟進(jìn)行了細(xì)菌分離與培養(yǎng)。通過16S rDNA測序和gdh基因PCR擴(kuò)增，確定細(xì)菌種類;用血清型特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定分離菌株的血清型;通過生長曲線測定、小鼠感染試驗和藥敏試驗對分離菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，分離菌株為豬鏈球菌2型;分離菌株的生長情況與豬鏈球菌2型SC19菌株相似，但最高OD595值略低于SC19菌株;分離菌株對小鼠具有高致病性;分離菌株主要對青霉素類和頭孢類藥物敏感。這說明豬鏈球菌2型很可能是該豬場發(fā)病豬的病原，該豬場對豬鏈球菌感染的防控應(yīng)優(yōu)先選用青霉素類和頭孢類藥物。

關(guān)鍵詞?豬鏈球菌;分離鑒定;血清型;致病性;藥敏試驗

中圖分類號?S?852.61文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2020）01-0087-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation， Identification and Biological Characterization of a Streptococcus suis Strain

ZHENG Cheng?kun1， JIA Meng?die1， WANG Yan?hong2，3

（1. College of Biosciences and Biotechnology， Yangzhou University， Yangzhou，Jiangsu 225009; 2. College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou，Jiangsu225009; 3. Jiangsu Co?innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou，Jiangsu225009）

Abstract?To detect the pathogen of diseased pigs from a pig farm in Yangzhou， bacterial isolation and culture were conducted on the heart sample of a diseased pig. The bacterial species were determined by 16S rDNA sequencing and PCR amplification of gdh gene. The serotype of the isolated strain was determined by PCR amplification using the serotype?specific primers. The biological characteristics of the isolated strain were explored by growth curve analysis， experimental infection of mice and antimicrobial susceptibility testing. The results showed that the isolated strain belonged to Streptococcus suis serotype 2. The isolated strain exhibited similar growth kinetics compared to S. suis 2 strain SC19， except that the maximum OD595 value was lower than that of strain SC19. The isolated strain also displayed high pathogenicity in a mouse infection model. Moreover， the isolated strain was sensitive to penicillins and cephalosporins. Collectively， the results suggested that S. suis 2 was likely to be the pathogen of the diseased pigs from the pig farm， and that penicillins and cephalosporins should be the preferred drugs for the prevention and control of S. suis infections.

Key words?Streptococcus suis;Isolation and identification;Serotype;Pathogenicity;Drug susceptibility test

豬鏈球菌是一種革蘭氏陽性致病菌，可以感染豬，導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。此外，豬鏈球菌可以通過傷口和胃腸道途徑感染人，引起腦膜炎和鏈球菌中毒性休克綜合征等[2]。根據(jù)莢膜多糖抗原的差異，豬鏈球菌目前被分為29個血清型[3]。其中1、2、7和9型為發(fā)病豬中最流行的血清型[4]。尤其是2型被認(rèn)為是全球范圍內(nèi)臨床分離率最高、致病性最強的血清型[5]。在1998和2005年，我國2次暴發(fā)大規(guī)模人感染豬鏈球菌疫情，分別導(dǎo)致25人感染、14人死亡和215人感染、39人死亡[6]。截至2013年，全球范圍內(nèi)累計報道了超過1 600例人感染豬鏈球菌病例[1]。近年來，國內(nèi)外仍然經(jīng)常見到人感染豬鏈球菌的病例報道[7-10]，說明豬鏈球菌對公眾健康和養(yǎng)豬業(yè)是一個持續(xù)的威脅。

最近揚州市某豬場發(fā)生一起疑似細(xì)菌感染事件，每天有3～5只豬（70日齡）死亡，持續(xù)5 d左右。筆者從該豬場送檢的病豬心臟中分離出1株細(xì)菌;經(jīng)16S rDNA測序和gdh基因擴(kuò)增證實該菌為豬鏈球菌;經(jīng)PCR鑒定，該豬鏈球菌為血清2型;小鼠感染試驗結(jié)果顯示，該菌具有較高的致病性;進(jìn)一步對該菌進(jìn)行了藥敏試驗，為豬場對豬鏈球菌感染的防控提供了參考依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?病料及試驗動物

病料為揚州市某豬場送檢的病豬心臟。雌性BALB/c小鼠（24只，SPF級，5周齡）購自南京市青龍山動物繁殖場。

1.2?主要試劑

16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit和PrimeSTAR Max Premix，購自寶生物工程（大連）有限公司;2×Taq Plus Master Mix Ⅱ和DL2000 Plus DNA Marker，購自南京諾唯贊生物科技有限公司;TSA（胰蛋白胨大豆瓊脂）和TSB（胰蛋白胨大豆肉湯）培養(yǎng)基，購自美國BD公司;新生牛血清為浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品;藥敏紙片為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3?細(xì)菌的分離純化與保藏

將病料剪開，用接種環(huán)深入病料內(nèi)部蘸取細(xì)菌，劃線接種于添加10%新生牛血清的TSA平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約20 h。挑取單菌落劃線接種于新的平板，進(jìn)行純化。再挑取單菌落，接種于添加10%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基，37 ℃搖床中培養(yǎng)約5 h，用甘油保菌，凍存于-20 ℃條件下，用于后續(xù)試驗。

1.4?細(xì)菌鑒定

參考16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit說明書，以純化細(xì)菌的基因組DNA為模板，用試劑盒中的16S rDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用Blastn進(jìn)行比對，以確定細(xì)菌種屬。同時，以純化細(xì)菌的基因組DNA為模板，用豬鏈球菌gdh基因特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步確定細(xì)菌種屬。

1.5?細(xì)菌血清型鑒定

參考文獻(xiàn)[11]設(shè)計豬鏈球菌血清1型（含14型）、2型（含1/2型）、7型和9型的特異性引物（表1）。以純化細(xì)菌的基因組DNA為模板，用4對分型引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送交北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果用Clustal Omega進(jìn)行多序列比對，以確定細(xì)菌血清型。

1.6?細(xì)菌生長曲線的繪制

挑取平板上的單菌落，接種于添加10%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基，37 ℃搖床中培養(yǎng)約5 h。將該菌液1∶100轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到96孔板中，每孔200 μL，設(shè)置5個重復(fù)。將96孔板置于37 ℃搖床中，每隔1 h取出，用酶標(biāo)儀測定OD595值，繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.7?小鼠感染試驗

將細(xì)菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期前期，取菌液5 000 r/min離心去上清，菌體用PBS重懸，并將細(xì)菌濃度調(diào)整到1×109 CFU/mL。將BALB/c小鼠隨機分為3組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每組8只。Ⅰ組小鼠腹腔感染2×108 CFU/只的分離菌株;Ⅱ組小鼠腹腔感染相同劑量的豬鏈球菌2型強毒株SC19[12];Ⅲ組小鼠腹腔注射200 μL PBS，作為對照。感染后觀察7 d，每隔12 h記錄1次小鼠癥狀及存活情況。

1.8?藥敏試驗

挑取平板上的單菌落，接種于添加10%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基，37 ℃搖床中培養(yǎng)過夜。用PBS將菌液稀釋到0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)，然后用滅菌棉簽將其均勻涂布于添加10%新生牛血清的TSA平板上。選取20種常用藥物的藥敏紙片，貼于涂布細(xì)菌的平板上，每塊平板上貼4個藥敏紙片。平板在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，取出并測量抑菌圈直徑。參考藥敏紙片說明書判定藥敏結(jié)果。

2?結(jié)果與分析

2.1?細(xì)菌的鑒定結(jié)果

分離的細(xì)菌在平板上形成圓形、光滑、有淡藍(lán)色熒光的小菌落，與豬鏈球菌的菌落特征相一致。采用PCR擴(kuò)增分離細(xì)菌的16S rDNA序列并測序，結(jié)果表明分離細(xì)菌為豬鏈球菌。用豬鏈球菌gdh基因特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增出大小為653 bp的DNA片段（圖1），進(jìn)一步證實分離的細(xì)菌為豬鏈球菌。將分離菌株命名為YZ1802。

2.2?細(xì)菌的血清型

用表1中的分型引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示用cps2I-1/cps2I-2引物擴(kuò)增出大小為314 bp的DNA片段，而用其他分型引物未擴(kuò)增出DNA片段（圖2），說明分離菌株YZ1802為血清2型或1/2型。參照文獻(xiàn)[11]可知，cps2I基因（GenBank號為KC537364.1）的第981個堿基為T，而cps1/2I基因（GenBank號為KC537384.1）的第981個堿基為C。將擴(kuò)增出的DNA片段測序后進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示第981個堿基對應(yīng)的位置為T（圖3），因此分離菌株YZ1802為血清2型。

2.3?分離菌株的生長曲線

生長曲線顯示，分離菌株YZ1802在接種后1 h進(jìn)入指數(shù)期，5 h進(jìn)入穩(wěn)定期;YZ1802菌株的生長情況與豬鏈球菌2型SC19菌株相似，但最高OD595值略低于SC19菌株（圖4）。

2.4?分離菌株的致病性

用小鼠感染模型評估分離菌株YZ1802的致病性。在感染后12 h，YZ1802組3只小鼠死亡，SC19組5只小鼠死亡;在感染后24 h，YZ1802組小鼠再死亡2只，SC19組小鼠再死亡3只?？傮w來看，YZ1802組小鼠死亡5只，SC19組小鼠全部死亡，對照組小鼠全部存活（圖5）。盡管YZ1802組存活的小鼠數(shù)量多于SC19組，結(jié)果顯示2組小鼠的存活率沒有顯著差異（P=0.089 8），說明YZ1802菌株同樣具有高致病性。

2.5?分離菌株的藥物敏感性

采用紙片擴(kuò)散法測定分離菌株的藥物敏感性，結(jié)果如表2所示，YZ1802菌株對13種藥物敏感，對7種藥物表現(xiàn)耐藥或中介。YZ1802菌株表現(xiàn)敏感的藥物主要是青霉素類（氨芐西林、羧芐西林、苯唑西林、青霉素、哌拉西林鈉）和頭孢類（頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢呋辛）。YZ1802菌株對氨基糖苷類中的慶大霉素表現(xiàn)敏感，而對該類別中的其他藥物（丁胺卡那、卡那霉素、新霉素）表現(xiàn)耐藥。此外，YZ1802菌株對大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素）和四環(huán)素類（四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素）藥物表現(xiàn)耐藥或中介。

3?討論與結(jié)論

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病原菌，其中2型是危害最嚴(yán)重的血清型[1]。該研究從揚州市某豬場送檢的病豬心臟中分離出1株細(xì)菌，用16S rDNA測序和PCR擴(kuò)增2種分子生物學(xué)方法證實該菌為豬鏈球菌。PCR法也經(jīng)常被用于豬鏈球菌血清型的鑒定，但該方法無法區(qū)分1型和14型、2型和1/2型[11]。該研究創(chuàng)新地將PCR法和DNA測序技術(shù)相結(jié)合，利用2型和1/2型豬鏈球菌莢膜多糖合成相關(guān)基因上的一個堿基差異，證實分離的豬鏈球菌為2型。該研究也對1型和14型豬鏈球菌的區(qū)分具有借鑒意義。

小鼠感染模型被廣泛用于豬鏈球菌毒力的評估[13]。因此，該研究以高致病性豬鏈球菌2型SC19菌株為參考菌株，用BALB/c小鼠評估分離菌株的毒力。雖然分離菌株感染組小鼠的死亡數(shù)量少于SC19菌株組，但2組小鼠的存活率沒有顯著差異，說明分離菌株同樣具有高致病性。據(jù)此可推斷豬鏈球菌2型感染很可能是該豬場豬發(fā)病的原因。

為了給豬場對豬鏈球菌病的防控提供參考，該研究檢測了分離菌株的藥物敏感性。結(jié)果顯示，分離菌株主要對青霉素類和頭孢類藥物敏感，對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類藥物表現(xiàn)耐藥或中介。該研究的藥敏試驗結(jié)果與Chen等[14]的研究結(jié)果類似。該豬場防控豬鏈球菌感染應(yīng)優(yōu)先選擇青霉素類和頭孢類藥物。

該研究分離到一株豬鏈球菌2型菌株，該菌株具有高致病性，很可能是引起豬場豬發(fā)病的病原菌。藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌株主要對青霉素類和頭孢類藥物敏感。該研究結(jié)果為豬場對豬鏈球菌感染的防控提供了參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] GOYETTE?DESJARDINS G，AUGER J P，XU J，et al.Streptococcus suis，an important pig pathogen and emerging zoonotic agent?an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing[J].Emerg Microbes Infect，2014，3（6）：1-20.

[2] SEGURA M，CALZAS C，GRENIER D，et al.Initial steps of the pathogenesis of the infection caused by Streptococcus suis：Fighting against nonspecific defenses[J].FEBS Lett，2016，590（21）：3772-3799.

[3] TIEN LE H T，NISHIBORI T，NISHITANI Y，et al.Reappraisal of the taxonomy of Streptococcus suis serotypes 20，22，26，and 33 based on DNA?DNA homology and sodA and recN phylogenies[J].Vet Microbiol，2013，162（2/3/4）：842-849.

[4] 張純瑤，解倩倩，宋子杰，等.豬鏈球菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2019（1）：69-72.

[5] FENG Y J，ZHANG H M，WU Z W，et al.Streptococcus suis infection：An emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases？[J].Virulence，2014，5（4）：477-497.

[6] YU H J，JING H Q，CHEN Z H，et al.Human Streptococcus suis outbreak，Sichuan，China[J].Emerg Infect Dis，2006，12（6）：914-920.

[7] 馮元貴，韓茹欣，馬賓.海南省首例人感染豬鏈球菌病流行病學(xué)調(diào)查[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2019，19（3）：298-300.

[8] 杜國明，鄒艷，陳海明，等.江蘇省蘇州市首例人感染豬鏈球菌病病例的調(diào)查報告[J].醫(yī)學(xué)動物防制，2019，35（7）：709-710.

[9] NEMETH A，KNAUSZ M，SCHMIDT P.Special case of purulent meningitis caused by Streptococcus suis.Case report[J].Orv Hetil，2019，160（1）：30-34.

[10] YANASE T，MORII D，KAMIO S，et al.The first report of human meningitis and pyogenic ventriculitis caused by Streptococcus suis：A case report[J].J Infect Chemother，2018，24（8）：669-673.

[11] LIU Z J，ZHENG H，GOTTSCHALK M，et al.Development of multiplex PCR assays for the identification of the 33 serotypes of Streptococcus suis[J].PLoS One，2013，8（8）：1-11.

[12] TENG L，DONG X X，ZHOU Y，et al.Draft genome sequence of hypervirulent and vaccine candidate Streptococcus suis strain SC19[J].Genome Announc，2017，5（3）：1-2.

[13] SEGURA M，F(xiàn)ITTIPALDI N，CALZAS C，et al.Critical Streptococcus suis virulence factors：Are they all really critical？[J].Trends Microbiol，2017，25（7）：585-599.

[14] CHEN L，SONG Y J，WEI Z G，et al.Antimicrobial susceptibility，tetracycline and erythromycin resistance genes，and multilocus sequence typing of Streptococcus suis isolates from diseased pigs in China[J].J Vet Med Sci，2013，75（5）：583-587.