舟山海域光參酶解嫩化工藝研究

周光東 位正鵬 霍健聰，3* 鄧尚貴

（1 浙江海洋學院食品與醫(yī)藥學院 浙江舟山 316000

2 榮成泰祥食品股份有限公司 山東榮成 264300

3 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室 浙江舟山 316000）

海參（Sea cucumber）為海參屬（Holothuroidea），是一種生活在淺海到數(shù)千米深海的海洋棘皮動物。我國是世界上為數(shù)不多的海參消費國，食用海參已有數(shù)千年的歷史。海參以其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有保健功效而深受消費者的歡迎，被列為“海八珍”之首，成為高檔海產(chǎn)品的典型代表。我國還是海參生產(chǎn)大國，主要分為兩類：刺參和光參。刺參也稱北參，主產(chǎn)于北方海域，以山東和遼寧為代表。刺參肉質(zhì)肥厚、營養(yǎng)豐富，成為海參市場的主要產(chǎn)品。而近年來隨著“抗生素刺參”、“糖干刺參”等食品安全事件的出現(xiàn)，市場對刺參的需求顯著降低。開發(fā)新的海參資源，以滿足市場對海參產(chǎn)品的旺盛需求成為當務之急。

光參（Cucumaria japonica）主產(chǎn)于南方各省份，有光參科、瓜參科和芋參科。光參目前全部為野生捕撈，尚無養(yǎng)殖光參，具有安全、天然等特點。長期以來，光參資源保有量大，其自體酶活性高，捕撈出水后需立刻進行剖殺、蒸煮、曬干等工藝處理，然而處理后的干光參體表極為堅硬，難以泡發(fā)，這一特點極大的限制了光參的市場需求，漁民捕獲后通常直接丟棄，部分進入市場的光參售價也僅為20～30元/kg，造成這類資源難以得到充分利用，經(jīng)濟價值、營養(yǎng)價值和保健價值未得到充分體現(xiàn)。目前關于光參的研究多集中在酶解產(chǎn)物特性上[1-3]，關于光參嫩化的系統(tǒng)研究成果寥寥無幾。在此背景下，本研究以舟山產(chǎn)光參為對象，利用復合酶對其進行生物嫩化，以降低光參硬度，提高食用品質(zhì)，為舟山海域光參資源的高值化開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

光參，浙江海士得食品有限公司。原料捕撈于舟山魚山漁場（28°00"-29°30"N，121°54"-125°00"E），捕撈出水后按傳統(tǒng)加工工藝立刻剖殺、去內(nèi)臟并蒸煮（100℃沸水中煮15min），蒸煮后的光參置于敷有碎冰的泡沫箱后運到實驗室；原料運抵實驗室后于烘箱內(nèi)烘干至水分含量約23%），即得干光參。

刺參，威海紅一切食品有限公司。泡發(fā)工藝：將干刺參置于自來水中浸泡3 h后換水，再浸泡6 h后換水，后每隔12 h換水浸泡，浸泡時間總計60 h，而后將海參瀝干水分放入普通家庭用高壓鍋，高壓處理15min，后將海參重新放置于純凈水中浸泡3 h后換水，而后每隔12 h換水浸泡，總計浸泡時間為72 h。刺參泡發(fā)結(jié)束后瀝干，置于冷藏室保存，即為泡發(fā)刺參。同樣按照刺參的泡發(fā)工藝對光參原料進行處理，即得泡發(fā)光參；原料經(jīng)浙江海洋學院海科學院鑒定為海地瓜（Acaudina molpadioides，以下簡稱光參）和刺參（Apostichopus japonicus）。

動物蛋白水解酶（28 000 U/g，自測）、中性蛋白酶（50 000 U/g）、胰蛋白酶（4 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司。試驗所用化學試劑均為分析純級，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

紫外分光光度計（U-2800）、高速冷凍離心機（CR21G），日本日立公司；TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀，美國FTC公司；pH 計（DECTA320A/C），瑞士梅特勒托利多公司；恒溫冷凍切片機（SYD-K2040），北京愛普瑞萊醫(yī)療器械有限公司；光學顯微鏡（BX51），日本奧林巴斯公司；透射電鏡（JEM-2100F），日本電子株式會社；其余均為試驗室常用設備。

1.2 試驗方法

1.2.1 光參酶解處理 通過預試驗初步確定選用動物蛋白水解酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶為初選酶制劑。在3種酶最佳酶解條件下（動物蛋白水解酶為50℃，pH 7.5；中性蛋白酶50℃，pH 7.0；胰蛋白酶為37℃，pH 8.0）進行酶解處理，3種酶制劑按照1U/g光參比例進行酶解，根據(jù)不同酶制劑對光參膠原蛋白的溶解度不同，確定2種最優(yōu)酶制劑；而后將2種酶制劑復配，做正交試驗（表1），其中酶濃度是指按照表中總濃度和比例進行分配，并按照各自酶活折算為酶制劑質(zhì)量。根據(jù)膠原蛋白溶解度確定最佳復配比例。

表1 復合酶的因素與水平Table1 Factor and level of compound enzyme

1.2.2 膠原蛋白溶解度的測定[4]稱取一定量光參體壁組織（4 g），加入質(zhì)量分數(shù)為25%Ringer液30mL，高速勻漿機處理10min后（10 000 r/min，搗碎時采用開機1min，關機30 s的方式處理），將勻漿液轉(zhuǎn)移到離心管，90℃水浴鍋中水浴1 h后將勻漿液進行離心處理（4 000 r/min，10min），后將上清液轉(zhuǎn)移到消化瓶中，在沉淀中重新加入10 mL同質(zhì)量分數(shù)的Ringer液，重新勻漿、離心，合并兩次上清液。向兩次提取后的上清液和沉淀中加入20，30mL濃度為7mol/L的硫酸，110℃條件下消化10 h，測定羥脯氨酸，其中上清液中膠原蛋白為可溶性，沉淀中為不溶性，然后折算為膠原蛋白含量[11]。膠原蛋白溶解度按照式（1）計算：

膠原蛋白溶解度（%）=可溶性膠原蛋白×100/（可溶性膠原蛋白+不溶性膠原蛋白）（1）1.2.3 質(zhì)構(gòu)特性分析 選用質(zhì)構(gòu)參數(shù)包括硬度、黏附型、彈性、咀嚼性、凝聚性和回復性等6項，質(zhì)構(gòu)儀測定模式為TPA模式，測定探頭直徑2mm，預壓速度3mm/s，下壓速度1mm/s，回復速度4 mm/s，壓縮量40%，兩次壓縮之間停留時間10 s，觸發(fā)力5 g。由得到的質(zhì)構(gòu)特性曲線可計算出光參的質(zhì)構(gòu)參數(shù)。硬度等參數(shù)計算參考孫彩玲等[5]和李云飛等[6]的方法。

1.2.4 光學顯微鏡觀測[7]光學顯微鏡觀測采用Van Gieson法。主要操作為：切片經(jīng)二甲苯脫蠟后再采用梯度乙醇“下行”至水，而后分別以Weigert，Mayer，Harris蘇木素染液深30min，流水沖洗使切片藍化，再蒸餾水漂洗，吸水紙吸干；Van Gieson染液染色5min，吸水紙吸干，95%酒精（滴加數(shù)滴苦味酸水溶液）分色數(shù)秒鐘，吸水紙吸干，無水乙醇脫水30 s后采用二甲苯透明，DPX膠封片。

1.2.5 透射電鏡觀測[8]酶解后的樣品用冷凍切片機處理后切成5μm切片，用2.5%戊二醛（由25%戊二醛溶液10mL，去離子水40mL，0.2mol/L

pH值為7.2的磷酸緩沖液50mL混合成100mL配制而成）固定2 h后涂片，用pH 7.2磷酸緩沖液細心洗滌3次，再用1%四氯化鋨固定1 h，磷酸緩沖液洗滌3次。以25%，50%，75%，95%乙醇按順序各脫水1次，每次10min，最后用無水乙醇重復脫水2次，每次10min。將涂片放入臨界點干燥器內(nèi)進行干燥，干燥后的涂片放入高真空蒸發(fā)器中噴金鍍膜后以電鏡觀察；同時制備未經(jīng)酶解處理的光參及干刺參和泡發(fā)刺參樣品。

1.2.6 主要活性成分測定 光參酶解前、后及刺參泡發(fā)前、后，多糖與皂甙含量測定采用國標法[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 光參質(zhì)構(gòu)特征

表2是不同原料初始質(zhì)構(gòu)參數(shù)。從表中可以看出，未經(jīng)處理的干光參和干刺參在彈性、咀嚼性等多個質(zhì)構(gòu)參數(shù)上除硬度外差距不大，表明兩種原料未經(jīng)處理時食用品質(zhì)均較低；而采用同樣泡發(fā)工藝處理后，刺參各項質(zhì)構(gòu)參數(shù)均優(yōu)于光參，其中以硬度最為典型，泡發(fā)后的刺參硬度僅為738 g，參體變軟，容易咀嚼，而泡發(fā)光參硬度仍然較高，達到1 287 g，參體堅硬，牙齒難以插入到肌肉中，難以食用，必須經(jīng)過處理降低硬度后才能食用。

表2 不同原料初始質(zhì)構(gòu)特征Table2 Original texture characters of different materials

2.2 酶制劑種類的確定

從表3可以看出，動物蛋白水解酶等3種酶制劑在其最佳酶解條件、處理相同時間后的酶解效果不同，其中胰蛋白酶酶解效果最差，且光參酶解后有腥味，硬度較大；而動物蛋白水解酶由蛋白內(nèi)切酶、外切酶和風味酶等組成，可通過內(nèi)切酶從中間切斷蛋白質(zhì)內(nèi)部的肽鏈，外切酶從多肽鏈的未端切斷釋放出氨基酸，且其中含有的風味酶對水解的苦味與風味起優(yōu)化作用；中性蛋白酶酶解效果介于兩者之間，硬度較小。故確定將動物蛋白水解酶和中性蛋白酶作為復配酶制劑組分。

表3 不同酶制劑處理效果Table3 Effects of different enzymic preparations

2.3 復合蛋白酶酶解工藝研究

將動物蛋白水解酶和中性蛋白酶復配，做正交試驗，試驗水平表見表3。

正交試驗結(jié)果見表4。由表4可以看出5個因子對光參的影響次序為：光參用量、溫度、復合比、酶量、pH值。綜合分析得出復合酶對光參最佳水解條件為：光參用量4 g/100mL，溫度40℃，復合比 1∶1，酶量 6×103IU/100mL，pH 7。按照該工藝進行驗證，膠原蛋白溶解度為62.4%，表明酶解效果最好，且酶解后的光參表皮并無顯著破損，表觀軟硬適中。同單酶法相比，復配酶制劑最大特點是降低了酶制劑用量，生產(chǎn)成本大大降低。

在復合酶最佳酶解條件下，分別選擇復合酶處理時間為15，30，45，60min，結(jié)果見表5。

表4 正交試驗結(jié)果與極差分析Table4 Results of orthogonal test and range analysis

表5 不同酶處理時間光參的質(zhì)構(gòu)特征Table5 Texture characters of different processing time

不同時間酶解處理后光參的質(zhì)構(gòu)特征結(jié)果見表5。從表中可以看出，硬度和咀嚼性變化趨勢相同，均隨酶解時間的延長而降低，表明光參表皮膠原蛋白在復合酶作用下逐漸降解，食用品質(zhì)逐漸提高；光參的凝聚性和回復性在酶解過程中變化較小，而黏附性隨酶解時間的延長逐漸升高，這是由于酶解時，膠原蛋白降解后的小分子氨基酸、多肽等物質(zhì)的親水性較強，造成光參表皮黏附性升高；而光參彈性也隨酶解時間的延長而逐步升高，這主要是由于光參硬度降低，且膠原蛋白經(jīng)復合酶處理后發(fā)生部分降解，親水性增強。此外，從表中還可以看出，鮮光參和泡發(fā)刺參在硬度等質(zhì)構(gòu)指標上較為接近，而酶解45min時，酶解光參的質(zhì)構(gòu)參數(shù)同鮮光參和泡發(fā)刺參接近。因此，確定復合酶酶解時間為45min。

圖1 復合酶處理后光參Fig.1 The Acaudina molpadioides after treatment with compound enzyme

2.4 光參復合酶酶解效果觀測

按照復合酶酶解工藝參數(shù)（光參用量4 g/100 mL，溫度40℃，復合比1∶1，酶量6×103IU/100 mL，pH 7，時間 1 h）處理光參，并采用 Van Gieson法染色后，膠原纖維被染成紅色，而肌肉纖維被染成黃白色，采用光學顯微鏡拍攝，如圖2所示。從圖中可以看出，不同樣品經(jīng)染色處理后都出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這些網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均為膠原蛋白網(wǎng)絡，而圖2a中網(wǎng)絡密度最高，圖2c和圖2d中網(wǎng)絡密度較小，這表明染色后樣品的網(wǎng)絡密度可以在一定程度上反映其食用品質(zhì)。其中，鮮光參網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)密度顯著低于干光參，而同泡發(fā)刺參密度相近，這表明在新鮮狀態(tài)時，光參食用品質(zhì)較高，而經(jīng)煮制熟化后的光參網(wǎng)格密度顯著升高，則其硬度上升，食用品質(zhì)下降；此外，從圖中還可以看出，經(jīng)過酶解處理后的光參體壁再經(jīng)染色后，發(fā)現(xiàn)紅色區(qū)域已經(jīng)大幅縮減，基本上無成型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，表明體壁膠原蛋白已經(jīng)發(fā)生降解；此外，從圖中還可以看出，經(jīng)酶解處理后的光參網(wǎng)格密度最低，表明其硬度最小，這也印證了表5的結(jié)果。

圖2 酶解前、后光參體壁結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Changes in the structure of the body wall before and after enzymatic hydrolysis

2.5 復合酶酶解電鏡照片觀測

按照復合酶酶解軟化工藝條件對光參進行酶解處理后采用透射電鏡得到圖3。圖3a～d分別為干光參、酶解光參、干刺參和泡發(fā)刺參透射電鏡圖。從圖3a、3c可以看出，干光參和干刺參色澤較深，質(zhì)地致密，纖維空隙小、緊密，表觀對應其硬度較高；而從圖3b、3d中可以看出，無論是經(jīng)過酶解處理的光參還是經(jīng)過泡發(fā)的刺參，其色澤明顯變淺，質(zhì)地由緊密變松散，尤其是干光參中粗大的纖維經(jīng)酶解后基本消減，酶解光參和泡發(fā)刺參參體也由堅硬變?yōu)槿彳?，硬度顯著降低。由此可見，采用動物蛋白水解酶和中性蛋白酶的混合處理可顯著降低光參硬度，實現(xiàn)軟化光參的目標。

圖3 光參酶解前、后透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopy before and after enzymatic hydrolysis

2.6 酶解處理前、后光參主要活性成分變化

表6表示酶解前、后光參多糖和皂甙的變化。從表中可以看出，刺參在泡發(fā)處理后兩種主要活性成分含量均有所降低，而降低幅度不大；光參酶解處理后多糖含量基本不變（降低0.04%），而皂甙含量反而上升一倍，達到688mg/100 g，這表明酶解軟化處理不僅對光參主要生理活性成分含量沒有任何影響，反而具有促進生理活性物質(zhì)含量提高的效應，對于光參的生物酶解軟化處理具有重要意義。

表6 酶解處理前、后光參及刺參主要活性成分比較Table6 Comparison of the main active components of Acaudina molpadioides and Apostichopus japonicus before and after enzymatic hydrolysis treatment

3 結(jié)論

1）酶制劑種類繁多，不同酶制劑對蛋白多肽鏈作用位點不同。本研究選用海產(chǎn)品中應用較多的3種酶制劑，即動物蛋白水解酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶作為初始酶制劑。通過試驗發(fā)現(xiàn)，動物蛋白水解酶酶解效果最好，中性蛋白酶酶解處理后光參腥味較輕，口感較好，因而選擇動物蛋白水解酶和中性蛋白酶為酶解用酶。

2）以膠原蛋白溶解度為測試指標，通過質(zhì)構(gòu)參數(shù)分析確定動物蛋白水解酶和中性蛋白酶的復合最佳酶解工藝參數(shù)為光參用量4 g/100mL，溫度40℃，復合比 1∶1，酶量 6×103IU/100mL，pH 7，時間1 h。

3）透射電鏡結(jié)果顯示酶解前、后光參表皮蛋白肌纖維結(jié)構(gòu)有較大變化，肌纖維由致密變疏松，達到了酶解軟化的目標。

4）生物酶解軟化處理后光參皂甙含量顯著提高，多糖含量略有降低。