靶向蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)在食物過(guò)敏原定量檢測(cè)中的應(yīng)用

蔣易蓉 任一平 陸柏益*

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州 310058

2 浙江清華長(zhǎng)三角研究院 浙江嘉興 314000）

食物過(guò)敏是一種過(guò)敏人群因攝入某些食物蛋白質(zhì)而產(chǎn)生不良免疫反應(yīng)的病理現(xiàn)象，時(shí)刻影響著過(guò)敏患者的生活質(zhì)量，甚至危害其生命安全。美國(guó)國(guó)家過(guò)敏和傳染病研究所（NIAID）在2010年的食物過(guò)敏診斷與治療報(bào)告中稱，全球約有1%～10%的人群正遭受食物過(guò)敏的威脅，其中兒童的發(fā)病率遠(yuǎn)高于成年人，并且食物過(guò)敏在全球的發(fā)病率以約18%的速度遞增[1-2]。目前，我國(guó)針對(duì)食物過(guò)敏的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)尚不完善，對(duì)于中國(guó)人群特有的食物過(guò)敏原仍處于未知，而食物過(guò)敏的發(fā)生率與全球的規(guī)律具有一定的相似性。黎海芪等[3]曾對(duì)重慶地區(qū)的嬰幼兒開展為期10年的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明在1999年至2009年期間，重慶地區(qū)0～1歲嬰幼兒中食物過(guò)敏的發(fā)病率從3.5%上升至7.7%。另有陳靜等[4]報(bào)道稱2009年我國(guó)重慶、珠海和杭州3個(gè)城市中0～1歲兒童食物過(guò)敏的發(fā)病率為3.8%～6.4%。

面對(duì)日益升高的食物過(guò)敏發(fā)病率，美國(guó)國(guó)家過(guò)敏和傳染病研究所（NIAID）、歐洲變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫學(xué)學(xué)院（EAACI）和澳大利亞衛(wèi)生與福利研究所（AIHW）等相關(guān)機(jī)構(gòu)都在食物過(guò)敏的流行病學(xué)調(diào)查、診斷、預(yù)防及治療等領(lǐng)域開展大量調(diào)查與研究工作[5]。研究成果表明，避免接觸食物過(guò)敏原是保護(hù)并防止確診病例再次受到過(guò)敏反應(yīng)危害的唯一有效途徑[6]。將食品中的過(guò)敏原成分明確標(biāo)注在標(biāo)簽上，是控制過(guò)敏原危害的最有效手段。美國(guó)國(guó)會(huì)于2004年通過(guò)了食物過(guò)敏原標(biāo)識(shí)與消費(fèi)者權(quán)益保護(hù)法案，旨在建立完善的風(fēng)險(xiǎn)管理體系，保障過(guò)敏患者的日常膳食與人身安全[7]。目前，我國(guó)的食物過(guò)敏原標(biāo)簽要求僅為建議標(biāo)識(shí)，而食物過(guò)敏原的準(zhǔn)確定量檢測(cè)，是制約食物過(guò)敏原風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與風(fēng)險(xiǎn)管理的重要瓶頸之一[8]。近年來(lái)，基于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)與高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立肽段篩選的流程與標(biāo)準(zhǔn)，確定可靠特征肽段作為目標(biāo)蛋白質(zhì)的生物標(biāo)志，開發(fā)食物過(guò)敏原的檢測(cè)平臺(tái)，具有良好的研究與發(fā)展前景[9]。

1 食物過(guò)敏原準(zhǔn)確定量檢測(cè)的重要性

現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)表明，全球約170種食物均能造成IgE介導(dǎo)的食物過(guò)敏反應(yīng)，而近90%的食物過(guò)敏由8大類過(guò)敏原引起，分別為牛乳、雞蛋、大豆、小麥、花生、堅(jiān)果、甲殼類和魚類[10]。其中，牛乳和雞蛋是嬰幼兒主要的營(yíng)養(yǎng)攝入來(lái)源，而兒童中牛乳和雞蛋過(guò)敏的發(fā)病率分別為0.8%～2.4%和2.8%～4.1%，而80%左右的兒童在4歲以后將不再具有牛乳和雞蛋過(guò)敏癥狀[11-13]。大豆過(guò)敏的發(fā)病率相對(duì)較低，約有0.3%～0.4%的兒童對(duì)大豆過(guò)敏[6，11]。花生過(guò)敏在白種人中的發(fā)病率高，可達(dá)1.4%～3.0%[14]。其中Ara h2蛋白可能是與榛子、杏仁等發(fā)生交叉反應(yīng)的主要抗原。甲殼類和魚類過(guò)敏在成人中具有較高的發(fā)病率，部分地區(qū)可高達(dá)17.8%～21.0%[15]。而麥麩過(guò)敏的定義仍存在爭(zhēng)議，現(xiàn)有研究表明，麥麩過(guò)敏引起的腸易激綜合征不屬于I型超敏反應(yīng)，為非IgE介導(dǎo)的過(guò)敏癥狀[16]。除8大類過(guò)敏原外，還有雞肉、芝麻、芹菜、茄子、菠蘿、蘋果、芒果、芥末等不常見的致敏食物近160種[17]。

依據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可知，常見的8大類食物過(guò)敏原為日常膳食的主要構(gòu)成與營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。因此，對(duì)于食物過(guò)敏患者來(lái)說(shuō)，避免攝入食物過(guò)敏原并非易事。研究學(xué)者提出，建立食物過(guò)敏原風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與風(fēng)險(xiǎn)管理平臺(tái)，是避免過(guò)敏消費(fèi)者意外攝入食物過(guò)敏原，保障過(guò)敏消費(fèi)者人身安全與生活質(zhì)量的重要手段[6]。食物過(guò)敏原的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估包括危害識(shí)別、劑量效應(yīng)評(píng)估、暴露評(píng)估與風(fēng)險(xiǎn)特征描述4個(gè)步驟，其風(fēng)險(xiǎn)主要來(lái)自食品加工過(guò)程交叉污染引起的隱蔽食物過(guò)敏原，并且針對(duì)不同人群其風(fēng)險(xiǎn)引發(fā)的危害具有顯著差異[18]。劑量效應(yīng)評(píng)估中致敏閾值的確定與暴露評(píng)估中市售食品隱蔽過(guò)敏原含量的評(píng)估是食物過(guò)敏原風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要內(nèi)容[19]。雙盲口服激發(fā)試驗(yàn)是確定食物過(guò)敏原致敏閾值的唯一標(biāo)準(zhǔn)方法，其試驗(yàn)陽(yáng)性的最低過(guò)敏原攝入水平即為致敏閾值，由口服激發(fā)食物中單一過(guò)敏原的含量確定，這提出了對(duì)食品中食物過(guò)敏原準(zhǔn)確定量的需求[20]。同時(shí)，市售食品中隱蔽食物過(guò)敏原含量的測(cè)定對(duì)食物過(guò)敏原準(zhǔn)確定量方法的檢出限、定量限、準(zhǔn)確度和精密度均提出了更高的要求[21]。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是識(shí)別危害、認(rèn)知風(fēng)險(xiǎn)的主要途徑，而風(fēng)險(xiǎn)管理是規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)防控制的重要手段。預(yù)包裝食品針對(duì)食物過(guò)敏原的標(biāo)簽標(biāo)識(shí)管理，是將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估成果轉(zhuǎn)化為風(fēng)險(xiǎn)管理的重要途徑。建立完善可靠的食品中食物過(guò)敏原的準(zhǔn)確定量方法，是支持過(guò)敏原標(biāo)簽管理的重要技術(shù)手段，是建立健全食物過(guò)敏原風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與風(fēng)險(xiǎn)管理平臺(tái)的重要技術(shù)基礎(chǔ)。

目前，食物過(guò)敏原蛋白的定量檢測(cè)方法主要分為基于目標(biāo)基因的PCR檢測(cè)技術(shù)，基于目標(biāo)抗原的免疫學(xué)測(cè)定技術(shù)以及基于目標(biāo)蛋白特征序列的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可利用熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)未知模板的定量分析，特異性強(qiáng)，靈敏度高[22]。然而，由于食物過(guò)敏原的致敏成分為蛋白質(zhì)而非物種DNA，此類通過(guò)測(cè)定DNA間接定量致敏蛋白的檢測(cè)方法存在一定的局限性?；谀繕?biāo)抗原的免疫學(xué)測(cè)定技術(shù)可分為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法、免疫印跡法和免疫層析法等。其中，酶聯(lián)免疫吸附法利用酶標(biāo)記的抗體與特異抗原結(jié)合，依據(jù)顏色反應(yīng)的強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)定性與定量分析，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短[23-24]。然而，ELISA方法的特異性主要依賴于抗原抗體的特異性結(jié)合，而加工食品中致敏原蛋白的結(jié)構(gòu)易因加熱、加壓等工藝發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，破壞抗原抗體的特異性結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陰性[25]。同時(shí)，復(fù)雜的食品基質(zhì)可能含有其它抗原與特異性抗體結(jié)合，造成檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性[26]。同基于免疫學(xué)原理的免疫印跡法與免疫層析法也存在類似問(wèn)題。相比較而言，基于目標(biāo)蛋白特征序列的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景[27]。其將傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)與質(zhì)譜定量技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)新型的蛋白質(zhì)準(zhǔn)確定量方法，包括鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)（Shotgun proteomics）、無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)（Label-free quantitative proteomics）與靶向蛋白質(zhì)組學(xué)（Target proteomics）。其中，靶向蛋白質(zhì)組學(xué)在食品中，食物過(guò)敏原的準(zhǔn)確定量檢測(cè)中，具有更好的表現(xiàn)[9]。

2 靶向蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)原理及關(guān)鍵步驟

靶向蛋白質(zhì)組學(xué)是把一個(gè)復(fù)雜體系中所有的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定的一門學(xué)科，其結(jié)合傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)庫(kù)信息與同位素稀釋質(zhì)譜技術(shù)的準(zhǔn)確定量能力，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量[28]。目前，靶向蛋白質(zhì)組學(xué)在食物過(guò)敏原的定量中，主要采用AQUA（Absolute quantification）定量策略，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中食物過(guò)敏原蛋白的準(zhǔn)確定量檢測(cè)。AQUA定量方法的建立主要包括定量肽段的篩選，同位素內(nèi)標(biāo)的設(shè)計(jì)，液相串聯(lián)質(zhì)譜采集方法的建立等關(guān)鍵步驟[29]。

2.1 定量特征肽段的篩選

靶向蛋白質(zhì)組學(xué)是利用測(cè)序級(jí)胰蛋白酶將目標(biāo)蛋白質(zhì)組特異性酶切后，通過(guò)測(cè)定定量特征肽段的摩爾質(zhì)量，從而準(zhǔn)確定量目標(biāo)蛋白質(zhì)。測(cè)序級(jí)胰蛋白酶是一種特異性強(qiáng)、酶切效率高的堿性蛋白酶，特異性酶解位點(diǎn)為賴氨酸與精氨酸的C末端，而當(dāng)賴氨酸與精氨酸后連接脯氨酸時(shí)，其失去酶切能力[30]。針對(duì)靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)步驟與原理可知，定量特征肽段的篩選是決定定量方法是否準(zhǔn)確的關(guān)鍵步驟，定量肽段應(yīng)滿足特異性強(qiáng)，酶切效率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，質(zhì)譜響應(yīng)高等要求[31]。而針對(duì)定量特征肽段的篩選，眾多學(xué)者提出了相應(yīng)的篩選策略，包括非實(shí)驗(yàn)依賴的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)模型與實(shí)驗(yàn)依賴的篩選模型。非實(shí)驗(yàn)依賴的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)模型包括 ESP（Enhanced signature peptide）predictor[32]以及PeptidesAtlas[33]等，ESP predictor利用隨機(jī)森林算法對(duì)已知肽段的質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行聚類分析與回歸分析，建立響應(yīng)最優(yōu)肽段的預(yù)測(cè)模型，從而對(duì)未知肽段的質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)，實(shí)現(xiàn)未知肽段的篩選[32]。而試驗(yàn)依賴的篩選模型主要為基于Skyline軟件的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，其利用已知數(shù)據(jù)結(jié)果對(duì)多目標(biāo)肽段進(jìn)行定性與定量分析，并對(duì)目標(biāo)肽段打分，依據(jù)分值實(shí)現(xiàn)定量特征肽段的篩選[34-35]。PeptidePicker[36]作為一個(gè)全面的肽段篩選指南，提出了若干條肽段篩選原則，包括①定量特征肽段具有高度的物種特異性；②定量特征肽段在ExPASy預(yù)測(cè)軟件中具有良好的酶切特性；③定量特征肽段的長(zhǎng)度宜在7～20個(gè)氨基酸之間；④定量特征肽段具有高度保守性，即在目標(biāo)蛋白質(zhì)的所有變異亞型中均存在；⑤定量特征肽段的氨基酸序列中避免出現(xiàn)甲硫氨酸（M）、半胱氨酸（C）、色氨酸（W）等不穩(wěn)定，易氧化的氨基酸。依據(jù)肽段篩選模型、策略與原則，篩選特異性強(qiáng)，酶切效率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，質(zhì)譜相應(yīng)高的定量特征肽段，為蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量奠定良好基礎(chǔ)。

2.2 同位素內(nèi)標(biāo)的設(shè)計(jì)

穩(wěn)定同位素稀釋質(zhì)譜技術(shù)是針對(duì)復(fù)雜食品基質(zhì)中目標(biāo)化合物準(zhǔn)確定量的重要技術(shù)，將已知質(zhì)量和豐度的穩(wěn)定同位素加入待測(cè)樣品中作為內(nèi)標(biāo)，校正復(fù)雜基質(zhì)引起的目標(biāo)化合物在質(zhì)譜離子化過(guò)程中的基質(zhì)效應(yīng)[37]。在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的AQUA定量策略中，由于目標(biāo)化合物為選定的定量特征肽段，因此其對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定同位素為同位素標(biāo)記的定量特征肽段。目前針對(duì)不同的定量需求，具有多種不同的同位素標(biāo)記策略，主要分為同位素標(biāo)記肽段的化學(xué)合成法與定量特征肽段的同位素衍生法。同位素標(biāo)記肽段的化學(xué)合成法即利用穩(wěn)定15N，13C同位素標(biāo)記的氨基酸脫水合成定量特征肽段，得到穩(wěn)定的同位素標(biāo)記肽段[38]。而肽段的同位素衍生法有多種選擇，包括二甲基衍生法和同位素親和標(biāo)簽衍生法等。其中，二甲基衍生法是利用肽段游離N末端對(duì)甲醛的親核力，實(shí)現(xiàn)N末端上雙甲基的衍生化反應(yīng)，同時(shí)，賴氨酸側(cè)鏈中含有的游離氨基同樣具有二甲基衍生化能力[39-40]。當(dāng)采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記甲醛作為反應(yīng)底物時(shí)，肽段實(shí)現(xiàn)同位素二甲基衍生化，獲得同位素標(biāo)記的定量特征肽段。此方法針對(duì)任何定量特征肽段均有衍生化效果，然而由于游離氨基數(shù)量的限制，針對(duì)不含賴氨酸的定量特征肽段，輕鏈與重鏈之間僅有6 amu的質(zhì)量數(shù)差異，針對(duì)帶兩個(gè)電荷的肽段來(lái)說(shuō)，只有3個(gè)質(zhì)荷比的差異，這對(duì)質(zhì)譜的分辨率提出較高的要求。同位素親和標(biāo)簽衍生法[41]是利用同位素標(biāo)記的生物素-連接子-碘乙酰胺與半胱氨酸側(cè)鏈的游離巰基反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)衍生化效果，其中連接子上帶有8個(gè)氫原子，均可替代為氘原子，實(shí)現(xiàn)輕鏈、重鏈8個(gè)質(zhì)量數(shù)的差異。然而，此方法只適用于含有半胱氨酸的定量特征肽段，而一般定量特征肽段不建議含有半胱氨酸，因此，此方法在實(shí)際應(yīng)用中存在局限性。目前，食物過(guò)敏原定量檢測(cè)方法中一般均采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的合成肽段作為穩(wěn)定同位素稀釋的內(nèi)標(biāo)，參與定量特征肽段的準(zhǔn)確定量。

2.3 質(zhì)譜方法的建立

質(zhì)譜采集方法的確定是實(shí)現(xiàn)特征肽段準(zhǔn)確定量的重要依據(jù)。文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)譜定量采集方法主要分為高分辨質(zhì)譜采集與低分辨質(zhì)譜采集。高分辨的質(zhì)量分析器主要為飛行時(shí)間質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜和靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜等，而低分辨的質(zhì)量分析器主要為三重四極桿質(zhì)譜或單四極桿質(zhì)譜。低分辨質(zhì)譜的SRM/MRM模式[42-43]，即選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，是小分子化合物的經(jīng)典定量采集模式，其基于三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的采集原理，實(shí)現(xiàn)化合物母離子對(duì)應(yīng)子離子的定量采集。相較于選擇離子檢測(cè)模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式受到基質(zhì)的干擾更小，基線更低，檢測(cè)靈敏度更高，準(zhǔn)確性更強(qiáng)。隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的日益成熟，采用高分辨質(zhì)譜采集模式實(shí)現(xiàn)食物過(guò)敏原定量檢測(cè)的實(shí)例越來(lái)越多[44]。然而，與傳統(tǒng)母離子/子離子對(duì)的串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)模式不同，高分辨質(zhì)譜多采用全掃描模式實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的定量分析。Monaci等[45]利用靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜的全掃描模式的提取離子流圖定量檢測(cè)白葡萄酒中殘留的牛乳過(guò)敏原，檢出限可達(dá)0.15～0.7μg/mL。近年來(lái)，針對(duì)多過(guò)敏原的同時(shí)檢測(cè)需求，由于低分辨的SRM/MRM模式與高分辨的PRM（平行反應(yīng)檢測(cè)）模式[46]的采集通道較多，操作較為繁瑣，有文獻(xiàn)報(bào)道采用高分辨質(zhì)譜的DIA模式實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的定量分析。DIA模式[47]，即數(shù)據(jù)非依賴采集模式，可針對(duì)一定質(zhì)荷比范圍內(nèi)的母離子分段進(jìn)入碰撞池得到其碎片離子的全掃描信息，再經(jīng)軟件對(duì)高分辨數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，得到母離子對(duì)應(yīng)子離子的匹配信息與定量結(jié)果。此方法可大大提高質(zhì)譜方法建立的工作效率，而目前未得到廣泛的應(yīng)用與認(rèn)可。

3 靶向蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定食物過(guò)敏原

引發(fā)IgE介導(dǎo)的食物過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原均為大分子蛋白質(zhì)，其包含有易與特異性IgE抗體結(jié)合的線性表位，引起I型超敏反應(yīng)[48]。致敏蛋白主要來(lái)自所有8 183個(gè)蛋白家族中的27個(gè)家族，包括醇溶谷蛋白家族、Cupin蛋白家族、Bet v 1蛋白家族等[49]。大豆過(guò)敏原蛋白主要來(lái)自Cupin蛋白家族，如7S-球蛋白（β-伴大豆球蛋白）和11S-球蛋白（大豆球蛋白）[50]。Cupin蛋白家族中的致敏蛋白多為高等植物種子的儲(chǔ)藏蛋白，包括花生中的Ara h 1蛋白、核桃中的Jug r 2蛋白和芝麻中的Ses i 3蛋白等[51]。而小麥過(guò)敏原蛋白中的麥醇溶蛋白和麥谷蛋白屬于醇溶谷蛋白家族[52]。牛乳中主要的營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)均為食物過(guò)敏原，包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白和牛免疫球蛋白等[53]。同樣，雞蛋中主要的營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)也均為食物過(guò)敏原，包括卵白蛋白、卵類黏蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶等。甲殼類中主要過(guò)敏原為原肌球蛋白，在結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性，而魚類中主要過(guò)敏原為小清蛋白，是肌肉中的一種鈣離子結(jié)合蛋白。針對(duì)致敏蛋白的分子基礎(chǔ)，靶向蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)在食物過(guò)敏原的檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用。

3.1 單一原料中食物過(guò)敏原的定量檢測(cè)

食物中主要過(guò)敏原含量的測(cè)定是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中雙盲口服激發(fā)試驗(yàn)必需的檢測(cè)技術(shù)。Johnson等[54]為口服激發(fā)試驗(yàn)食物原料中的花生過(guò)敏蛋白建立了定量方法，然而，由于其未使用同位素標(biāo)記方法定量，其定量的準(zhǔn)確性不足。Houston等[55]采用AQUA-MRM方法對(duì)大豆中10種過(guò)敏原進(jìn)行定量檢測(cè)，其含量為0.5～5.7μg/mg大豆蛋白。同時(shí)，由于大豆品種變化繁多，研究對(duì)20個(gè)大豆品種中的10種過(guò)敏原分別進(jìn)行準(zhǔn)確定量，發(fā)現(xiàn)用于定量的特征肽段在20個(gè)大豆品種中均能適用，可有效排除品種變異導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果的不確定性。脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白Zea m 14是玉米中主要的致敏蛋白，而Zea m 14蛋白所在的LTP蛋白家族中具有與Zea m 14序列相似的LTPb和LTPc蛋白。為實(shí)現(xiàn)玉米中Zea m 14過(guò)敏原的準(zhǔn)確定量，Stevenson等[56]利用AQUA-MRM方法篩選出Zea m 14的特征肽段NAAAGVSGLNAGNAASIPSK用于不同玉米品種中Zea m 14蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定性與定量。結(jié)果表明，Zea m 14蛋白可與LTPb和LTPc良好區(qū)分并分別定量檢測(cè)，并且在21個(gè)不同玉米品種中，Zea m 14蛋白的含量在檢出限至30μg/mg蛋白不等，其中5個(gè)品種玉米中的Zea m 14蛋白含量低于檢出限。牛乳過(guò)敏原是人們主要關(guān)注的動(dòng)物過(guò)敏原之一。Zhang等[57]利用AQUA-MRM方法對(duì)乳清粉和嬰幼兒配方乳粉中的α-乳白蛋白進(jìn)行定量，方法定量限可達(dá)10mg/100 g樣品。Feng等[58]對(duì)牛乳中的α-酪蛋白進(jìn)行檢測(cè)，檢出限可達(dá)0.5mg/L樣品。

3.2 復(fù)雜加工食品中食物過(guò)敏原的定量檢測(cè)

食品加工過(guò)程的復(fù)雜性對(duì)食物過(guò)敏原的定量檢測(cè)提出了更高的要求。高熱、高壓、發(fā)酵等加工過(guò)程均會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)，甚至一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。利用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)食物過(guò)敏原可有效避免過(guò)敏原蛋白因三級(jí)結(jié)構(gòu)或二級(jí)結(jié)構(gòu)變化引起的檢測(cè)不確定性。Huschek等[59]利用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選特征肽段，對(duì)焙烤食品中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和Ses i 6芝麻蛋白建立定量方法，方法回收率為70%～113%，定量限可達(dá)10 ppm，然而，由于該方法為使用同位素稀釋法，其定量結(jié)果有待驗(yàn)證。發(fā)酵或酶切的加工過(guò)程會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，對(duì)穩(wěn)定可靠的特征肽段的篩選提出了更高的要求。Liao等[60]針對(duì)“無(wú)麩質(zhì)”的發(fā)酵食品建立了小麥和大麥麩質(zhì)的AQUA-MRM定量檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)2.5 mg/kg麩質(zhì)的檢出限。其中前期利用Q-TOF質(zhì)譜技術(shù)對(duì)發(fā)酵食品中的特征肽段進(jìn)行全面篩選，確定穩(wěn)定可靠的特征肽段，并合成同位素特征肽段作為內(nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)小麥和大麥麩質(zhì)的定量檢測(cè)。

食品加工過(guò)程亦可造成不必要的過(guò)敏原污染情況，導(dǎo)致隱蔽過(guò)敏原現(xiàn)象的發(fā)生。紅酒中因加工過(guò)程需要常加入卵白蛋白或牛酪蛋白作為沉淀劑，而卵白蛋白或牛酪蛋白的殘留易造成過(guò)敏患者不必要的人身危害。Mattarozzi等[61]利用卵白蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白的特征肽段實(shí)現(xiàn)紅酒中微量致敏蛋白的殘留檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)0.01～0.8 μg/mL樣品，其中卵白蛋白的檢出限為0.8μg/mL。Pilolli等[62]利用 MSIA D.A.R.T.’STM技術(shù)實(shí)現(xiàn)卵白蛋白的富集，并利用特征肽段的MRM質(zhì)譜分析，實(shí)現(xiàn)紅酒中卵白蛋白的定量檢測(cè)，檢出限可達(dá)0.05μg/mL。目前在紅酒中的隱蔽過(guò)敏原檢測(cè)均未用到同位素內(nèi)標(biāo)，這對(duì)前處理要求和基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估提出較高要求。巧克力和曲奇中的花生過(guò)敏原也是重要的隱蔽過(guò)敏原，在歐洲、美洲等地區(qū)受到消費(fèi)者的強(qiáng)烈關(guān)注。Pedreschi等[63]利用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)烘焙曲奇中隱蔽花生過(guò)敏原的檢測(cè)?；ㄉ兄旅舻鞍椎姆N類繁多，而Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3是主要的花生過(guò)敏原，其中Ara h 3的豐度最高，占總蛋白含量的21.8%～38.5%。方法篩選Ara h 3的特征肽段AHVQVVD SNGNR和SPDIYNPQAGSLK用于總花生含量的測(cè)定，其花生含量的檢出限可滿足10μg/g樣品的要求。Shefcheck等[64]利用Ara h 1中的特征肽段DLAFPGSGEQVEK作為定量標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)巧克力中花生過(guò)敏原的定量檢測(cè)，方法檢出限可達(dá)2mg花生蛋白/kg樣品。

3.3 復(fù)雜食品基質(zhì)中食物過(guò)敏原組的定量檢測(cè)

近年來(lái)，已有學(xué)者將靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于食物中過(guò)敏原組的定量分析檢測(cè)，可有效提高食物過(guò)敏原檢測(cè)效率，實(shí)現(xiàn)多過(guò)敏原的同時(shí)檢測(cè)。Gu等[65]利用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了巧克力中牛乳過(guò)敏原、大豆過(guò)敏原、花生過(guò)敏原和堅(jiān)果過(guò)敏原的檢測(cè)，定量限分別為0.2～0.4μg/g，1.0～4.0 μg/g，2.5～4.0μg/g以及1.0～3.0μg/g。Monaci等[66]針對(duì)曲奇復(fù)雜基質(zhì)建立了過(guò)敏原組的檢測(cè)方法，包括雞蛋過(guò)敏原、牛乳過(guò)敏原、大豆過(guò)敏原、花生過(guò)敏原和堅(jiān)果過(guò)敏原。Planque等[67]針對(duì)巧克力、冰激凌、番茄醬和曲奇等復(fù)雜基質(zhì)食品建立了牛乳過(guò)敏原、雞蛋過(guò)敏原、花生過(guò)敏原和大豆過(guò)敏原的定量分析方法，其中酪蛋白檢出限為0.5mg/kg，乳清蛋白檢出限為5mg/kg，花生蛋白檢出限為2.5mg/kg，大豆蛋白檢出限為5mg/kg，雞蛋白檢出限為3.4mg/kg以及雞蛋黃檢出限為30.8mg/kg。而上述方法采用的特征肽段各不相同，方法間的比較也存在諸多挑戰(zhàn)，為更好的解決食物過(guò)敏原定量檢測(cè)的技術(shù)問(wèn)題，應(yīng)建立并完善靶向蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)的操作標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)體系，使其向標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)劃化的目標(biāo)更近一步。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著食物過(guò)敏的發(fā)生率日益增長(zhǎng)，食物過(guò)敏原的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與風(fēng)險(xiǎn)管理的重要性也不斷提高。在傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等生物技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合高靈敏度、高精密度和高準(zhǔn)確性的有機(jī)質(zhì)譜技術(shù)，開發(fā)靶向蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)用于食物過(guò)敏原的定量檢測(cè)，相較于現(xiàn)有基因技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)具有更好的定性和定量分析表現(xiàn)。其方法的建立需要依據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，有針對(duì)性的篩選特征肽段，設(shè)計(jì)同位素內(nèi)標(biāo)并建立質(zhì)譜定量方法，實(shí)現(xiàn)并解決已知的科學(xué)問(wèn)題。然而，靶向蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)還未成熟，仍處于發(fā)展完善階段，受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。其特征肽段的篩選標(biāo)準(zhǔn)，同位素內(nèi)標(biāo)的設(shè)計(jì)依據(jù)，質(zhì)譜方法的建立要求都沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)完善的操作指南。目前，基于現(xiàn)有的AQUAMRM策略已建立多種食品基質(zhì)中多種過(guò)敏原的定量檢測(cè)方法，然而，方法的準(zhǔn)確性與方法間的可比性仍沒(méi)有良好的評(píng)價(jià)指標(biāo)。針對(duì)解決食品中食物過(guò)敏原準(zhǔn)確定量檢測(cè)的科學(xué)問(wèn)題，建立并完善靶向蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，是研究學(xué)者們需要共同努力的方向。