養(yǎng)心氏片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的作用機(jī)制研究

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病，冠心病(CAD)是其主要疾病之一，冠心病又稱缺血性心臟病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(2014)報(bào)告，缺血性心臟病是全世界死亡的主要原因之一，每年700多萬(wàn)人死于缺血性心臟病[1]。目前，中醫(yī)藥治療冠心病的研究取得了良好的療效。多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)證明，養(yǎng)心氏片(YXS)治療冠心病療效較好，但其機(jī)制研究較少，本實(shí)驗(yàn)研究養(yǎng)心氏片治療AS模型小鼠的可能作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料 雄性載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠40只，雄性C57BL/6J小鼠8只，均為SPF級(jí)，動(dòng)物購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(京)2014-0004?；A(chǔ)飼料：由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。高脂飼料為購(gòu)于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司的乳脂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物純化飼料MD12015(21%乳脂，0.15%膽固醇)。

1.2 藥物及制備 養(yǎng)心氏片(由青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)股份有限公司提供，薄膜衣片，批號(hào)081204)，阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，薄膜衣片，批號(hào)H20051408)，將養(yǎng)心氏片或阿托伐他汀鈣片研磨后溶解于蒸餾水中，配制成濃度為0.140 g/mL、0.070 g/mL、0.035 g/mL的養(yǎng)心氏片高、中、低劑量組及濃度為0.257 mg/mL的阿托伐他汀鈣片，按動(dòng)物體重給藥，每10 g動(dòng)物給藥0.1 mL。

1.3 試劑及儀器 FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒[批號(hào)KR116，天根生化科技(北京)有限公司]；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒[批號(hào)DP431，天根生化科技(北京)有限公司]；SuperReal熒光定量預(yù)混試劑 [批號(hào)FP205，天根生化科技(北京)有限公司]；DNA酶1[批號(hào)RT411，天根生化科技(北京)有限公司]；β-巰基乙醇(天津市江天化工技術(shù)有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)756MC)；Veriti PCR 熱循環(huán)儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)4375786)；熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)7500fast)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)BH-2)；體視鏡(德國(guó)，LEICA公司)；LEICA CM1900組織包埋機(jī)(德國(guó)Leica公司)；低速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司，型號(hào)LDZ5-2)；引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成。

1.4 動(dòng)物造模及給藥 8周齡雄性C57BL/6J小鼠及ApoE-/-小鼠，均飼養(yǎng)于天津市人民醫(yī)院動(dòng)物房小鼠飼養(yǎng)籠內(nèi)，每籠2只，飼養(yǎng)室恒溫(22±2)℃。人工光照明暗各12 h。所有小鼠在予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，C57BL/6J小鼠繼續(xù)予普通飼料喂養(yǎng)，ApoE-/-小鼠予高脂飼料喂養(yǎng)12周復(fù)制AS模型。ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)12周后，將其隨機(jī)分為模型組、養(yǎng)心氏片高劑量組、養(yǎng)心氏片中劑量組、養(yǎng)心氏片低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組8只。C57BL/6J小鼠8只作為正常對(duì)照組。給藥方法：養(yǎng)心氏片高、中、低劑量組分別給予1.40 g/(kg·d)、0.70 g/(kg·d)、0.35 g/(kg·d)，相當(dāng)于70 kg成人臨床劑量的2倍、1倍、0.5倍的養(yǎng)心氏片灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予2.57 mg/(kg·d)阿托代他汀鈣，相當(dāng)于成人20 mg/d臨床劑量的阿托伐他汀鈣片灌胃，每日1次；模型組及正常對(duì)照組給予等量的高溫滅菌蒸餾水灌胃，每日1次。灌胃時(shí)間為12周。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色及升主動(dòng)脈斑塊校正后斑塊面積測(cè)定 灌胃12周后處死小鼠，小鼠處死后迅速打開胸腔，左心室逆行灌注液體至主動(dòng)脈，鈍性分離主動(dòng)脈(從升主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉處)，自頭臂干分叉處向近心端取主動(dòng)脈0.3 cm(升主動(dòng)脈)置于4%的多聚甲醛中固定，備做病理標(biāo)本。常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度5 μm，采用HE染色，用Image J 軟件檢測(cè)血管面積及斑塊面積。測(cè)量管腔面積(LA)、內(nèi)彈力膜圍繞面積(IELa)，計(jì)算斑塊面積(PA)及校正后斑塊面積。斑塊面積=IELa-LA， 校正后斑塊面積=PA/IELa。其余組動(dòng)脈于-80 ℃冰箱保存。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)法檢測(cè)主動(dòng)脈組織各因子 檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA的表達(dá)。采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取小鼠主動(dòng)脈組織總RNA，微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品純度。然后按照反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR反應(yīng)體系及條件按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以GAPDH作為內(nèi)參照基因，GAPDH上游：5′-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3′，GAPDH下游：5′-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3′；MCP-1上游： 5′-CCACTCACCTGCTGCTACTCATTC-3′，MCP-1下游：5′-CTGCTGCTGGTGATCCTCTTGTAG-3′；VCAM-1上游：5′-ATCTCAGGTGGCTGCACAAGTTG-3′，VCAM-1下游：5′-AGCGCACAGGTAAGAGTGTTCATC-3′；IL-6上游：5′-ACTTCCATCCAGTTGCCTTCTTGG-3′，IL-6：下游 5′-TTAAGCCTCCGACTTGTGAAGTGG-3′；TNF-α上游：5′-GCGACG TGGAACTGGCAGAAG-3′，TNF-α下游： 5′-GCCACAAGCAGGAATGAGAAGAGG-3′；NF-κB上游：5′-GACACGACAGAATCCTCAGCATCC-3′，NF-κB下游：5′-CCACCAGCA GCAGCAGACATG-3′；PCR反應(yīng)條件：95 ℃，10 min； 95 ℃，15 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；循環(huán)40次。然后進(jìn)行20 min的產(chǎn)物溶解程序，作溶解的曲線分析，將不同濃度的定量模板對(duì)數(shù)和相應(yīng)的CT值作圖。結(jié)果判定：△CT= CT- CTGAPDH。用各實(shí)驗(yàn)組樣本的△CT減去正常對(duì)照組樣本的△CT，得到△△CT，以2-△△CT表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠升主動(dòng)脈HE染色結(jié)果 正常對(duì)照組小鼠動(dòng)脈管腔未見(jiàn)明顯改變，管壁外、中、內(nèi)膜3層結(jié)構(gòu)明顯，內(nèi)膜光滑無(wú)增厚，內(nèi)皮細(xì)胞完整連續(xù)，內(nèi)膜下無(wú)沉積的脂質(zhì)及斑塊形成，彈力板完整，中膜血管平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)呈梭形，整齊排列；模型組小鼠主動(dòng)脈壁有明顯的斑塊形成，管腔狹窄，內(nèi)皮細(xì)胞缺失或不完整，內(nèi)膜表面不光滑，斑塊內(nèi)可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)，脂質(zhì)豐富，膽固醇結(jié)晶形成，有時(shí)可見(jiàn)斑塊破裂、出血、血栓形成。各藥物治療組主動(dòng)脈亦可見(jiàn)內(nèi)膜增厚、斑塊形成，但與模型組相比較，斑塊病變減輕，斑塊面積減小，泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)減少，膽固醇結(jié)晶減少。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠升主動(dòng)脈HE染色結(jié)果

2.2 各組小鼠升主動(dòng)脈斑塊校正后斑塊面積比較 各給藥組與模型組相比，升主動(dòng)脈斑塊校正后斑塊面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與養(yǎng)心氏片高劑量組相比，養(yǎng)心氏片低劑量組與養(yǎng)心氏片中劑量組升主動(dòng)脈斑塊校正后斑塊面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且升主動(dòng)脈斑塊校正后斑塊面積隨養(yǎng)心氏片劑量水平的上升而逐漸下降，呈量效關(guān)系，而養(yǎng)心氏片高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組升主動(dòng)脈斑塊校正后斑塊面積相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

2.3 各組小鼠主動(dòng)脈NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組小鼠相比，模型組及各給藥組小鼠主動(dòng)脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。各給藥組小鼠主動(dòng)脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平低于模型組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。養(yǎng)心氏片高劑量組小鼠主動(dòng)脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平低于養(yǎng)心氏片低劑量組及養(yǎng)心氏片中劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性，即小鼠主動(dòng)脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平隨養(yǎng)心氏片給藥劑量的增加而下降。養(yǎng)心氏片高劑量組小鼠主動(dòng)脈NF-κB、MCP-1、VCAM-1、TNF-α、IL-6表達(dá)水平與陽(yáng)性對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

表1 各組小鼠升主動(dòng)脈斑塊校正后斑塊面積水平(±s) mm2

與模型組比較，1)P<0.05；與養(yǎng)心氏片高劑量組比較，2)P<0.05

表2 各組小鼠主動(dòng)脈NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)水平比較(±s)

1)與正常對(duì)照組比較，P<0.05；2)與模型組比較，P<0.05；3)與養(yǎng)心氏片高劑量組相比，P<0.05

3 討 論

AS的治療一直是研究的熱點(diǎn)，AS是一種由多種因素導(dǎo)致的慢性血管性炎癥性疾病，目前臨床上治療AS主要采用介入治療或降脂治療，介入治療風(fēng)險(xiǎn)較大，而降脂藥長(zhǎng)期服用易損傷肝功能，停藥后血脂水平極易反彈，甚至比未用降脂藥之前血脂水平更高，導(dǎo)致很多病人不能長(zhǎng)期耐受。中醫(yī)診治具有辨證論治及整體治療的雙重特點(diǎn)，中藥毒副作用小，長(zhǎng)期服用無(wú)明顯不適，耐受性強(qiáng)，其作用多靶點(diǎn)、多途徑，可根據(jù)病人的情況調(diào)整用藥，較西藥用藥更加靈活，可作為治療AS的一種長(zhǎng)期有效的療法。

多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證明，養(yǎng)心氏片對(duì)冠心病具有良好療效，養(yǎng)心氏片源于著名老中醫(yī)周次清的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由人參、黃芪 、丹參、醋延胡索等13味藥物組成，具有益氣活血、化瘀止痛的功效。以“養(yǎng)心理論”為指導(dǎo)思想所創(chuàng)造的養(yǎng)心氏片，圍繞著“心主血、心主脈、心藏神”的生理功能，體現(xiàn)著養(yǎng)心氏片以補(bǔ)為養(yǎng)、以通為養(yǎng)、以安為養(yǎng)的學(xué)術(shù)思想，主治冠心病氣虛血瘀證。統(tǒng)計(jì)顯示：冠心病的13種中醫(yī)證型中氣虛血瘀證占13.85%，排名第三，而在腦梗死13種中醫(yī)證型中，氣虛血瘀證占19.42%，排名第二[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示：長(zhǎng)春地區(qū)肥胖合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的四大主要證型之一是氣虛血瘀證[3]。由此可見(jiàn)AS常見(jiàn)證型是氣虛血瘀證。

近年來(lái)有大量的研究關(guān)于NF-κB活性抑制藥延緩AS病程的報(bào)道，故NF-κB信號(hào)通路在AS進(jìn)程中起關(guān)鍵作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，從早期的脂質(zhì)氧化、內(nèi)皮細(xì)胞受損，到AS斑塊的形成，始終伴隨著炎癥反應(yīng)，而在AS形成中，參與炎癥反應(yīng)的很多重要炎癥因子都是 NF-κB 的靶基因，NF-κB信號(hào)通路調(diào)控了這些炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[5]。典型的NF-κB是由多肽鏈p50和p65亞基組成，當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB與抑制蛋白(IκB)結(jié)合形成三聚體，其在細(xì)胞質(zhì)中以無(wú)活性的形式存在[6]，當(dāng)細(xì)胞受到外界信號(hào)刺激時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化并降解，此時(shí)NF-κB逃離IκB的控制而被激活，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與靶基因相應(yīng)部位結(jié)合，開啟相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[7-8]。在 AS中，NF-κB 是黏附分子、趨化因子、細(xì)胞因子、炎癥因子以及生長(zhǎng)因子的重要調(diào)控因子，可促進(jìn)斑塊的形成與發(fā)展，最終導(dǎo)致斑塊破裂引起冠心病以及腦卒中等危重心血管疾病的發(fā)生[9-10]。NF-κB是一類具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄作用的因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生是通過(guò)激活多種細(xì)胞因子表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，目前已知細(xì)胞黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[11]。TNF-α通過(guò)正負(fù)反饋激活NF-κB，引起炎癥持續(xù)發(fā)生導(dǎo)致AS。TNF-α以通過(guò)激活 NF-κB 信號(hào)途徑，促使大量的炎癥因子與黏附分子在內(nèi)皮細(xì)胞合成，這些因子可以激活或者募集各類炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，加速血管氧化、炎癥反應(yīng)及血栓形成[12]。VCAM-1是免疫球蛋白超家族的成員，在機(jī)體受到致炎因子如TNF-α、IL-6的刺激下，VCAM-1的表達(dá)會(huì)增加，參與淋巴細(xì)胞的活化與遷移，并在炎癥過(guò)程中起重要作用[13]。NF-κB可調(diào)控TNF-α、IL-6、VCAM-1、MCP-1的表達(dá)，一方面，TNF-α、IL-6可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VCAM-1，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附至血管內(nèi)皮，衍變成為泡沫細(xì)胞，另一方面，TNF-α、IL-6促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)MCP-1，可趨化單核細(xì)胞遷移入動(dòng)脈內(nèi)皮下層，然后巨噬細(xì)胞通過(guò)攝取氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)形成泡沫細(xì)胞，加速動(dòng)脈粥樣斑塊的形成，更重要的是，TNF-α、IL-6可進(jìn)一步活化NF-κB，促進(jìn)TNF-α、IL-6、MCP-1、VCAM-1的表達(dá)，形成一個(gè)惡性循環(huán)，加劇AS的發(fā)展[4]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，養(yǎng)心氏片可降低主動(dòng)脈NF-κB信號(hào)通路下游相關(guān)因子TNF-α、IL-6、VCAM-1、MCP-1的表達(dá)。表明養(yǎng)心氏片可通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路降低炎癥反應(yīng)，減少趨化單核細(xì)胞在受損血管內(nèi)皮處轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，減緩泡沫細(xì)胞的形成，發(fā)揮AS的作用，而養(yǎng)心氏片高劑量組對(duì)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子的調(diào)節(jié)效果與阿托伐他汀無(wú)明顯差異。提示養(yǎng)心氏可有效改善AS，其機(jī)制可能與降低AS小鼠升主動(dòng)脈斑塊校正后斑塊面積及下調(diào)主動(dòng)脈NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子 mRNA的表達(dá)有關(guān)。