血小板活化相關(guān)信號(hào)通路上下游信號(hào)分子的研究現(xiàn)狀

血栓形成是血栓性疾病的主要病理過(guò)程，多項(xiàng)臨床研究均表明，血栓性疾病病人普遍存在血小板聚集性和黏附性升高的情況因此抑制血小板激活、抗血小板聚集是抗血栓的重要環(huán)節(jié)，在血栓性疾病防治過(guò)程中具有重要意義[1-3]。血小板膜中有許多糖蛋白，即血小板膜受體，通過(guò)偶聯(lián)蛋白將胞外信號(hào)傳遞到胞內(nèi)。本研究以受體-偶聯(lián)蛋白作為中間環(huán)節(jié)，將與血小板膜受體結(jié)合的配體作為血小板活化上游的誘導(dǎo)因子，將偶聯(lián)蛋白下游信號(hào)通路上的各種蛋白激酶及血小板激活后標(biāo)志物作為下游效應(yīng)信號(hào)及分子，進(jìn)行綜述，闡明血小板聚集過(guò)程中血小板活化上下游的分子及信號(hào)，以期為闡明中藥抗血小板作用及機(jī)制提供思路。

1 血小板膜受體、偶聯(lián)蛋白及相關(guān)通路

1.1 受體-Gi偶聯(lián)蛋白途徑 環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是Gi途徑的第二信使，實(shí)驗(yàn)研究表明當(dāng)cAMP產(chǎn)生減少時(shí)，血小板發(fā)生聚集，因此升高cAMP水平可以抑制血小板活化[4-5]。P2Y12受體是2001年新發(fā)現(xiàn)的與Gi蛋白偶聯(lián)血小板膜受體，可以抑制cAMP產(chǎn)生[6]，有研究表明其激活后介導(dǎo)α顆粒的釋放、P選擇素的表達(dá)，從而放大血小板聚集。并且有臨床研究表明，P2Y12受體功能缺陷的病人血小板致密顆粒的數(shù)量濃度是正常的，但是依賴(lài)P2Y12受體增強(qiáng)顆粒分泌釋放的作用減弱[7]。另一個(gè)與Gi蛋白偶聯(lián)的是TPβ受體，通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途徑將配體的活化信號(hào)進(jìn)一步傳遞，最終使血小板膜上GPⅡb/Ⅲa活化，引起血小板的聚集。血小板生理結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 血小板生理結(jié)構(gòu)圖

1.2 受體-Gq偶聯(lián)蛋白途徑 與Gq偶聯(lián)蛋白偶聯(lián)的受體包括TP受體(thromboxane-prostanoid receptor)、蛋白酶體活化受體(protease-activated receptors，PAR)和P2Y1受體，都能介導(dǎo)跨膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。激動(dòng)劑激動(dòng)與Gq蛋白偶聯(lián)的受體，通過(guò)磷脂酰肌醇代謝途徑，分解4，5 二磷酸( phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2)產(chǎn)生第二信使IP3和DAG動(dòng)員鈣池釋放和外鈣內(nèi)流，使血小板內(nèi)Ca2+增加，誘發(fā)血小板變形和血栓素A2(TXA2)產(chǎn)生，發(fā)揮始動(dòng)血小板聚集的作用[9-10]，還可以引起微循環(huán)障礙和炎癥反應(yīng)。

1.3 受體-G12/13偶聯(lián)蛋白途徑 有研究表明，同樣與TPα受體偶聯(lián)的G12/13蛋白同樣介導(dǎo)血小板內(nèi)Ca2+濃度升高改變血小板細(xì)胞骨架引起激活血小板。

1.4 無(wú)偶聯(lián)蛋白的膜受體 另有一些血小板膜受體無(wú)偶聯(lián)的蛋白，如GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合物為一個(gè) GPIbα亞基以二硫鍵連接2個(gè)GPIbβ分子，并以非共價(jià)連接 GPIX 和 GPV，其中 GPIbα、GPIbβ、GPIX 和 GPV 的分子數(shù)之比為 2∶4∶2∶1。GPIbα是血小板表面凝血酶的高親和力受體，呈富含亮氨酸重復(fù)(LRR)結(jié)構(gòu)區(qū)域的細(xì)長(zhǎng)的香蕉狀[11]，其胞外片段由 300 個(gè)氨基酸殘基組成。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后其表面膠原和血管性血友病因子(VWF)暴露，與GPIbα結(jié)合使得血小板以滾動(dòng)方式黏附在損傷血管表面激活血小板[12]，同時(shí)啟動(dòng)血小板信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終導(dǎo)致血小板相互聚集成團(tuán)，形成血小板血栓[13]。另外整合素α2β1又稱(chēng)為第二膠原受體，同樣介導(dǎo)膠原誘導(dǎo)的血小板活化，主要是加強(qiáng)GPVI受體活化后的后續(xù)內(nèi)外信號(hào)調(diào)節(jié)互相配合協(xié)作的過(guò)程[14]。

2 上游：胞外血小板活化激動(dòng)劑

不同血小板活化激動(dòng)劑引起血小板聚集的能力強(qiáng)弱不同，其中凝血酶、膠原屬于強(qiáng)誘導(dǎo)劑；血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸(AA)為中等強(qiáng)度誘導(dǎo)劑；二磷酸腺苷(ADP)、5-羥色胺(5-HT)屬于弱誘導(dǎo)劑；而腎上腺素只能在超過(guò)生理濃度下發(fā)揮作用[15]。

2.1 強(qiáng)誘導(dǎo)劑 凝血酶作為最強(qiáng)的血小板活化激動(dòng)劑，是凝血酶原被凝血因子Ⅹa激活后經(jīng)一系列裂解得到的活性狀態(tài)[16]。凝血酶原是由肝臟合成的單鏈糖蛋白，具有579個(gè)氨基酸殘基，作為凝血過(guò)程第Ⅱ因子，具有與Ca2+、磷脂和第Ⅴa因子結(jié)合的位點(diǎn)，在凝血過(guò)程中被FXa激活，生成凝血酶。凝血酶具有A、B兩條鏈，含有309個(gè)氨基酸殘基。B鏈有259個(gè)氨基酸殘基，作為凝血酶功能鏈具有典型的絲氨酸蛋白水解酶折疊結(jié)構(gòu)[17]，能夠裂解纖維蛋白原而形成纖維蛋白凝塊。凝血酶還具有兩個(gè)陰離子結(jié)合外部位點(diǎn)ABEⅠ和ABEⅡ，分別與不同配體結(jié)合，且存在相互抑制作用[18]。研究表明，當(dāng)ABEⅠ與纖維蛋白原、血小板受體PAR1結(jié)合后，凝血酶構(gòu)型發(fā)生變化為Fast構(gòu)型[18]，具有促凝血功能；ABEⅡ與其配體結(jié)合后的凝血酶構(gòu)型稱(chēng)為Slow構(gòu)型，可以催化具有抗凝血作用的蛋白C活性。凝血酶既可以與血小板膜G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合最終引起血小板聚集，其中凝血酶受體PAR1可以介導(dǎo)低濃度凝血酶激活血小板的信號(hào)，PAR4只能介導(dǎo)高濃度凝血酶的活化信號(hào)[19]，血小板糖蛋白Ib能夠提高凝血酶激活PAR1的效率[20]。另外凝血酶與GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體結(jié)合后通過(guò)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、PI3K和 Src 家族激酶( Src family kinases，SFKs) 可引起復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，加速血栓生成[21]。

2.2 中等強(qiáng)度誘導(dǎo)劑 TXA2是體內(nèi)花生四烯酸AA在環(huán)氧化酶(cyclooxygenase COX)和血栓素合成酶(thromboxane synthase，TX)作用下轉(zhuǎn)化而成，可以正反饋的增強(qiáng)血小板活化聚集反應(yīng)。通過(guò)結(jié)合特異性細(xì)胞膜受體TXA2受體(TXA2R)由3中不同偶聯(lián)蛋白Gq、G12/13、Gi分別介導(dǎo)活化過(guò)程，強(qiáng)烈誘導(dǎo)血小板聚集，使平滑肌收縮和增生，在多種疾病的發(fā)生中起主要作用。生理狀態(tài)下前列環(huán)素(PGI2)與TXA2兩者處于動(dòng)態(tài)平衡，發(fā)揮相反的作用，而病理狀況下TXA2居主導(dǎo)作用，使血小板發(fā)生聚集。除了血小板合成的TXA2有強(qiáng)烈的血小板聚集 、血管收縮和促使平滑肌細(xì)胞遷移的作用，單核和血管平滑肌細(xì)胞也可產(chǎn)生TXA2，并且促發(fā)上述病理變化。

PAF是一種內(nèi)源性具有強(qiáng)效生物活性的磷脂，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮著多種多樣的生理作用。PAF與受體結(jié)合后，通過(guò)第二信使IP3和DAG發(fā)揮激活血小板的作用，最終導(dǎo)致血小板變形和聚集。

2.3 弱誘導(dǎo)劑 ADP是血小板激活后釋放的血小板激動(dòng)劑，可介導(dǎo)血小板的二次激動(dòng)，通過(guò)增強(qiáng)自身及其他誘導(dǎo)劑對(duì)血小板的誘導(dǎo)，起到穩(wěn)定血小板聚集作用。目前普遍接受的是ADP與P2Y1受體結(jié)合，始動(dòng)血小板活化[22]，與血小板P2Y12受體結(jié)合，通過(guò)偶聯(lián)蛋白進(jìn)一步激動(dòng)血小板活化的信號(hào)通路。

另一個(gè)弱血小板誘導(dǎo)劑5-HT與ADP同樣存在于血小板活化釋放的致密顆粒中，其與偶聯(lián)蛋白受體結(jié)合后引起的血小板聚集是極弱的可逆性聚集，但是5-HT尚可增強(qiáng)膠原、ADP等激活血小板的作用[23]。

3 下游：偶聯(lián)蛋白傳遞信號(hào)的“效應(yīng)器”及產(chǎn)生的效應(yīng)

3.1 信號(hào)通路上的“效應(yīng)器” 研究發(fā)現(xiàn)，血小板G蛋白通路激活后下游有許多重要的信號(hào)分子，包括PI3K、PLC、PKC、Src等，最終介導(dǎo)血小板釋放、變形、聚集等反應(yīng)。P2Y12受體激活后下游重要的效應(yīng)器有Rap1b， Akt， and potassium channels鉀離子通道和PI3K-γ[24-26]。

PI3K是由調(diào)節(jié)亞基 p85及催化亞基 p110組成的蛋白酶，一系列細(xì)胞因子、蛋白激酶 C、RAS、胞外信號(hào)激酶等可結(jié)合調(diào)節(jié)亞基 p85，活化催化亞基 p110導(dǎo)致二聚體結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變，進(jìn)而發(fā)揮活化效應(yīng)。PI3K 其主要通過(guò)在磷脂酰肌醇的肌醇環(huán)三位進(jìn)行磷酸化產(chǎn)生胞內(nèi)重要的Gq偶聯(lián)蛋白通路的第二信使 PIP3而發(fā)揮作用[27]。IP3是Gq蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中PIP2在PLC的催化作用下水解形成的一種水溶性分子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為第二信使，與內(nèi)質(zhì)膜或液泡膜上的IP3-閘門(mén)Ca2+通道結(jié)合，使通道打開(kāi)，引起Ca2+超載，導(dǎo)致血小板活化。

cAMP水平由內(nèi)皮細(xì)胞攝取AA后，經(jīng)環(huán)氧酶(COX)和血小板白細(xì)胞聚集體(platelet-leukocyte aggregates，PLA)生成的PGI2激活A(yù)C決定。AC激活后，使胞內(nèi)cAMP升高，cAMP通過(guò)升高ATP依賴(lài)的蛋白激酶(PKA)，磷酸化PLC；抑制與Ca2+連接的蛋白激酶的活性，降低血小板與平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，發(fā)揮抑制血小板活化聚集作用。

3.2 信號(hào)通路產(chǎn)生的效應(yīng) 血小板膜糖蛋白分為質(zhì)膜糖蛋白和顆粒膜糖蛋白，在血小板活化聚集時(shí)分別具有不同的作用，血小板GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物是血小板膜上含量最多的糖蛋白，與膠原、vWF、纖維連接蛋白等結(jié)合，導(dǎo)致血小板的黏附和聚集[28]，促進(jìn)原位血栓的形成[29]。GPIb/IX(CD42b-CD42a)、GPIa/Ⅱa(CD49b-CD29)在血小板聚集時(shí)發(fā)揮黏附作用。α顆粒膜蛋白GMP-140(CD62p)又叫P選擇素、血小板P-選擇蛋白，是血小板α顆粒膜表面和內(nèi)皮細(xì)胞VW小體膜表面的選擇素家族的一員[30]，作為血小板活化的特異分子標(biāo)志，血漿中P選擇素是以循環(huán)蛋白形式存在的，正常情況下，體內(nèi)血漿中GMP-140較低，只有當(dāng)血小板活化后，該蛋白血漿中可溶性P選擇素水平會(huì)增加，從而反映血小板活化程度[31-32]。研究表明，血小板激活后漿膜的立刻酶解產(chǎn)生的P選擇素[33-34]， 具有血小板與炎性細(xì)胞相互連接作用，通過(guò)與白細(xì)胞表面表達(dá)的P選擇素糖蛋白受體-1(PSGL-1)結(jié)合，形成PLA[35]。 生理狀態(tài)下，體內(nèi)PLA含量極低，當(dāng)血小板活化后，血小板膜表面的糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和P選擇素(CD62P)表達(dá)增加，則生成的PLA增多。同樣有實(shí)驗(yàn)表明在血栓形成中，血栓中活化血小板上表達(dá)的P選擇素發(fā)揮募集白細(xì)胞的作用[36]。血小板與白細(xì)胞的相互反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣斑塊破裂中具有重要意義，可作為心血管疾病中的重要指標(biāo)。

β-血小板球蛋白(β-thromboglobulin，β-TG)和血小板第4因子(platelet factor 4，PF4)是血小板激活后由血小板釋放的標(biāo)志物，利用放射免疫法測(cè)定其可用于研究血小板的釋放功能和反映血小板的狀態(tài)。

4 總結(jié)與展望

血栓形成是多靶點(diǎn)、多途徑激活血小板的結(jié)果，血小板活化過(guò)程主要包括血小板黏附、聚集、釋放。其中參與黏附的分子有纖維蛋白原、GPⅡb/Ⅲa、vWF等，參與聚集的激動(dòng)劑有凝血酶、血栓素、膠原、ADP等，血小板激活后釋放的分子有β-TG和PF4，以及作為激動(dòng)劑的TXA2、ADP等。血小板活化后最終通過(guò)膜表面表達(dá)的GPⅡb/Ⅲa受體與纖維蛋白原的結(jié)合實(shí)現(xiàn)血小板聚集，可見(jiàn)GPⅡb/Ⅲa受體是抗血小板聚集的重要靶點(diǎn)。

血栓形成時(shí)，西醫(yī)治療包括溶栓、經(jīng)皮動(dòng)脈介入和冠狀動(dòng)脈搭橋等多種方法，能夠快速開(kāi)通狹窄堵塞的血管段，及時(shí)恢復(fù)相應(yīng)血管供血區(qū)的血液供應(yīng)。但是這些西醫(yī)措施均為疾病發(fā)生后的補(bǔ)救措施，只在疾病急性發(fā)生時(shí)隨即進(jìn)行治療，則在一定程度上會(huì)減少缺血引起的組織細(xì)胞損傷。目前，臨床上廣泛應(yīng)用的口服抗血小板藥在疾病的二級(jí)預(yù)防中有重要意義，主要包括環(huán)氧化酶抑制劑(如阿司匹林)，ADP受體抑制劑(如氯吡格雷、替格瑞洛)。但是這兩類(lèi)藥物只能抑制TXA2、ADP誘導(dǎo)的血小板活化聚集，對(duì)于膠原、凝血酶等激動(dòng)劑沒(méi)有直接抑制作用，且抗血小板藥物低反應(yīng)現(xiàn)象或抵抗現(xiàn)象普遍存在。GPⅡb/Ⅲa受體作為血小板聚集的最后通路，其拮抗劑目前批準(zhǔn)上市的有阿昔單抗、依替巴肽和替羅非班，在血栓形成或急性冠脈綜合征病人治療中具有強(qiáng)效抗血小板聚集作用，具有起效快半衰期短、可逆性抗血小板聚集的特點(diǎn)，但需謹(jǐn)慎用藥以防出血事件發(fā)生。

隨著對(duì)血小板活化分子機(jī)制的研究，使得這些活化激動(dòng)劑、受體等成為探索抗血小板藥物的靶點(diǎn)，尤其為闡明活血化瘀中藥多靶點(diǎn)、多通路抗血小板作用及機(jī)制提供了研究的可能性，因此，系統(tǒng)闡明血小板激活過(guò)程中中藥抗血小板研究具有重要意義。