阿托伐他汀通過(guò)調(diào)控張力蛋白同源第10染色體丟失的磷酸酶基因/蛋白激酶B通路減少豬冠狀動(dòng)脈微栓塞后心肌細(xì)胞的凋亡

陳涵 王琛 張龍巖 鄢華 蘇晞 王江友

冠狀動(dòng)脈微栓塞（coronary microembolization，CME）是急性冠狀動(dòng)脈綜合征及介入治療圍術(shù)期常見(jiàn)并發(fā)癥，主要由于醫(yī)源性或自發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊破裂及腐蝕所導(dǎo)致［1］。有研究顯示，CME發(fā)生與冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流/慢血流存在直接相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷及近遠(yuǎn)期心功能明顯下降，即使心外膜血流恢復(fù)正常，心功能依然進(jìn)行性下降［2］。一旦發(fā)生CME，目前包括藥物及器械相關(guān)保護(hù)措施均不能改善患者近遠(yuǎn)期臨床預(yù)后［3］。因此，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）圍術(shù)期CME所致并發(fā)癥仍是臨床醫(yī)師所面臨的難題。

既往本課題組動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CME發(fā)生后，局部心肌將發(fā)生微小面積壞死灶，周邊心肌細(xì)胞出現(xiàn)大范圍凋亡現(xiàn)象，心功能呈現(xiàn)進(jìn)行性惡化的現(xiàn)象［4］。半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（cysteine containing aspartate specific protease，Caspase-3）是細(xì)胞凋亡通路中至關(guān)重要的蛋白，也是促細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子及最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者。既往動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CME發(fā)生后，在微梗死灶周圍，發(fā)現(xiàn)有大量心肌細(xì)胞凋亡，證實(shí)其中的機(jī)制可能是CME誘發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，增加心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷及收縮功能惡化，且通過(guò)抑制Caspase-3蛋白表達(dá)，能夠降低心肌細(xì)胞的凋亡，明顯改善心臟功能，這進(jìn)一步證實(shí)了CME致心功能不全發(fā)生機(jī)制與Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［5-8］。

張力蛋白同源第10染色體丟失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是最常見(jiàn)的腫瘤抑制突變基因，參與調(diào)控細(xì)胞的正常發(fā)育過(guò)程，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、粘連、遷移、侵襲和凋亡［9］。有研究表明，PTEN能夠在各種刺激下加快各類細(xì)胞發(fā)生凋亡［10］。既往本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在豬CME模型中抑制PTEN/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路，降低促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能［5］。另外，本課題組研究亦證實(shí)，阿托伐他汀能夠降低促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能［6］。阿托伐他汀除了具有降低膽固醇作用外，還具有多種心血管益處，包括抗炎和抗細(xì)胞凋亡。近年來(lái)，許多研究進(jìn)一步驗(yàn)證了其在心肌缺血再灌注損傷、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死和腎缺血再灌注損傷動(dòng)物模型中的抗細(xì)胞凋亡作用［11-14］。本研究設(shè)想，是否能夠使用阿托伐他汀預(yù)處理，降低CME后心肌細(xì)胞凋亡，并且闡明其主要通過(guò)抑制調(diào)控PTEN/Akt通路，降低Caspase-3表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)？另外，前期動(dòng)物試驗(yàn)顯示，CME后12 h心肌細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰［4］。因此本研究以在成功建立CME模型后12 h作為研究觀察時(shí)間，進(jìn)行各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指標(biāo)的對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

12 周齡健康小型豬15頭，雌雄不限，體重21～25 kg，隨機(jī)分為假手術(shù)組、CME組、CME＋阿托伐他汀組［CME建立前阿托伐他汀預(yù)處理（連續(xù)服用7 d，每日20 mg，CME前負(fù)荷80 mg］，每組5頭。

1.2 CME模型建立

CME模型的建立將參考既往研究團(tuán)隊(duì)建立的標(biāo)準(zhǔn)［4］。首先肌內(nèi)注射氯胺酮首劑麻醉，手術(shù)過(guò)程中給予地西泮靜脈（耳緣靜脈）維持麻醉狀態(tài)，采用外科方式皮膚切口，逐步分流出右側(cè)股動(dòng)脈血管，穿刺置入7 F股動(dòng)脈鞘管，注射肝素達(dá)到肝素化（200 U/kg），手術(shù)＞1 h追加1次肝素（100 U/kg）。采用PCI法，操控指引導(dǎo)絲將微導(dǎo)管送至左前降支中段（第一對(duì)角支發(fā)出處），之后緩慢注入42 μm的微栓塞球45 ml，在30～40 min內(nèi)注射完畢。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

建模前及成功建立CME模型后12 h使用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組豬左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室短軸縮短率（lef t ventricular f raction shortening，LVFS）及心輸出量（cardiac output，CO）。所有指標(biāo)由具有超聲心動(dòng)圖經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師測(cè)量及計(jì)算。

1.4 心肌梗死面積測(cè)量

超聲心動(dòng)圖檢測(cè)后處死動(dòng)物，取出相應(yīng)部位心肌組織，按照蘇木精堿性品紅苦味酸（hematoxylin basic fuchsin picric，HBFP）染色步驟操作，每張病理切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（放大100倍），測(cè)量梗死區(qū)域，梗死面積比例由占總切片的面積百分比獲得。

1.5 心肌細(xì)胞TUNEL染色

DNA末端TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，并進(jìn)行半定量分析，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；隨機(jī)觀察切片上5個(gè)400倍高倍視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞核總數(shù)和凋亡心肌細(xì)胞，計(jì)算凋亡比例。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)

將心肌組織勻漿化，并使用等分試樣進(jìn)行測(cè)定，使用洗滌劑相容性測(cè)定法測(cè)定每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品（100 μg）加載到聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后封閉硝酸纖維素膜，4℃與一抗孵育過(guò)夜。 兔抗PTEN，兔抗Akt、p-Akt（磷酸化位點(diǎn)蘇氨酸-308）和兔抗Caspase-3及cleaved-Caspase-3購(gòu)自Abcam公司。Western blot是用二抗在室溫下處理1 h，然后暴露于X線膠片。 掃描X線膠片，通過(guò)Bio-Rad圖像分析（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）測(cè)定光密度。

1.7 肌鈣蛋白I測(cè)定

建模前及成功建立CME模型后12 h檢測(cè)各組豬血漿肌鈣蛋白I水平，采用免疫化學(xué)發(fā)光法測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心功能指標(biāo)比較

CME組術(shù)后12 h LVFS［（26.42±2.63）%比（42.83±2.35）%］、LVEF［（51.34±4.23）%比（66.78±3.98）%］、CO［（2.62±0.38）L/min比（4.25±0.58）L/min］與假手術(shù)組比較，呈現(xiàn)顯著下降，而LVEDD與假手術(shù)組比較，明顯增加［（40.95±1.39）mm比（32.68±1.85）mm］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。CME＋阿托伐他汀組LVEF［（58.32±5.38）%比（51.34±4.23）%］、LVFS［（32.35±3.86）%比（26.42±2.63）%］、CO ［（3.50±0.47）L/min比（2.62±0.38）L/min］與CME 組比較，呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，LVEDD與CME 組比較，呈現(xiàn)降低趨勢(shì)［（34.82±1.69）mm比（40.95±1.39）mm］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表1）。

2.2 各組肌鈣蛋白I比較

CM E組術(shù)后12 h 肌鈣蛋白I與假手術(shù)組比較，明顯升高［（0.325±0.189）ng/ml 比（0.062±0.012）ng/ml，P=0.023］；CME＋阿托伐他汀組肌鈣蛋白I與CME組比較，有下降趨勢(shì)［（0.142±0.095）ng/ml比（0.325±0.189）ng/ml，P=0.035］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 CME 病理學(xué)改變

HE染色顯示微梗死灶內(nèi)心肌細(xì)胞核消失或溶解，細(xì)胞胞漿呈紅染，梗死灶周邊細(xì)胞變性、水腫，周圍炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)及紅細(xì)胞滲出（圖1 A～B）。HBFP染色發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組未見(jiàn)明顯心肌微梗死灶；CME組和CME＋阿托伐他汀組均可見(jiàn)多處心肌微梗死灶，呈局灶性分布，非透壁性，以內(nèi)膜下和左心室多見(jiàn)（圖1 C～D）。CME＋阿托伐他汀組梗死面積比例明顯低于CME組［（6.38±3.89）%比（10.28±5.69）%，P=0.027］。

表1 CME 術(shù)后12 h 心功能指標(biāo)的變化（n=5，）

表1 CME 術(shù)后12 h 心功能指標(biāo)的變化（n=5，）

注：a，與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；b，與CME 組比較，P ＜0.05；CME，冠狀動(dòng)脈微栓塞；LVEF，左心室射血分?jǐn)?shù)；LVEDD，左心室舒張末期內(nèi)徑；LVFS，左心室短軸縮短率；CO，心輸出量

項(xiàng)目 假手術(shù)組 CME 組 CME ＋阿托伐他汀組LVEF （%） 66.78±3.98 51.34±4.23a 58.32±5.38ab LVFS （%） 42.83±2.35 26.42±2.63a 32.35±3.86ab LVEDD （mm） 32.68±1.85 40.95±1.39a 34.82±1.69ab CO （L/min） 4.25±0.58 2.62±0.38a 3.50±0.47ab

2.4 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌細(xì)胞凋亡改變

凋亡心肌細(xì)胞TUNEL染色細(xì)胞核呈棕黃色，正常細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。CME后心肌細(xì)胞凋亡主要存在于微梗死灶及其周圍，假手術(shù)組偶見(jiàn)心肌細(xì)胞凋亡存在于心內(nèi)膜下與乳頭肌處（圖2）。CME組心肌細(xì)胞凋亡比例與假手術(shù)組比較明顯增加［（12.98±5.69）%比（0.15±0.10）%，P=0.038］；CME＋阿托伐他汀組心肌細(xì)胞凋亡比例與CME組比較明顯減少［（7.89±4.26）%比（12.98±5.69）%，P=0.048］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 1 HE染色及HBFP染色圖 A.假手術(shù)組心肌組織HE染色，未見(jiàn)明顯異常；B.CME術(shù)后12 h微梗死相關(guān)區(qū)域HE染色（箭頭所示為微動(dòng)脈內(nèi)的微栓塞球，×400）；C.CME＋阿托伐他汀組心室前壁心肌組織微梗死相關(guān)區(qū)域HE染色（箭頭所示為微動(dòng)脈內(nèi)的微栓塞球，×200），梗死程度及炎癥浸潤(rùn)幅度明顯少于CME組。D.假手術(shù)組心肌組織HBFP染色，未見(jiàn)明顯心肌壞死染色；E.CME術(shù)后12 h微梗死灶區(qū)域HBFP染色（粗箭頭示微梗死灶染成紅色，細(xì)箭頭示微栓塞球，×100）；F.CME＋阿托伐他汀組心室前壁心肌組織微梗死相關(guān)區(qū)域HBFP染色（粗箭頭示微梗死灶染成紅色，細(xì)箭頭示微栓塞球，×100），梗死面積明顯少于CME組

圖 2 心肌細(xì)胞凋亡TUNEL染色圖 A.假手術(shù)組心肌組織TUNEL染色，可見(jiàn)散在細(xì)胞凋亡（箭頭示心肌細(xì)胞凋亡染成棕黃色，×200）；B.CME組術(shù)后12 h微梗死灶區(qū)域TUNEL染色（箭頭示心肌細(xì)胞凋亡染成棕黃色，×200）；C.CME＋阿托伐他汀組心室前壁心肌組織微梗死相關(guān)區(qū)域TUNEL染色（箭頭示心肌細(xì)胞凋亡染成棕黃色，×200），心肌細(xì)胞凋亡明顯少于CME組

2.5 心肌組織蛋白的表達(dá)

Western blot定量分析顯示，CME組心肌細(xì)胞PTNE表達(dá)與假手術(shù)組比較，明顯升高［（0.86±0.35）%比（0.25±0.12）%，P=0.034］；p-Akt表達(dá)與假手術(shù)組比較，明顯下降［（0.37±0.15）% 比（0.92±0.27）%，P=0.032］；cleaved-Caspase-3含量與假手術(shù)組比較，顯著增加［（1.12±0.42）% 比（0.21±0.13）%，P=0.025］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CME＋阿托伐他汀組p-Akt表達(dá)與CME組比較，顯著增加［（0.82±0.25）%比（0.37±0.15）%，P=0.033］；cleaved-Caspase-3含量與CME組比較，顯著下降［（0.58±0.35）% 比（1.12±0.42）%，P=0.042］（圖3）。

3 討論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，向犬的冠狀動(dòng)脈內(nèi)注入微栓塞球，犬的冠狀動(dòng)脈血流短暫減少后即刻可恢復(fù)正常，但心肌的收縮功能呈現(xiàn)進(jìn)行性的下降現(xiàn)象，表明CME致心肌損傷的機(jī)制并非由心外膜血管血流減少所決定［15］。本課題組既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，微栓塞所致的壞死心肌的面積占總心肌面積不到5%，微栓塞所致心肌細(xì)胞壞死不足以完全解釋心肌收縮功能障礙［4-8，16］。

圖 3 心肌細(xì)胞蛋白表達(dá)圖 A～C.PTEN、p-Akt、Akt、cleaved-Caspase-3及Caspase-3 Western blot圖；D.PTEN蛋白統(tǒng)計(jì)結(jié)果；E.p-Akt蛋白統(tǒng)計(jì)結(jié)果；F.Akt蛋白統(tǒng)計(jì)結(jié)果；G.cleaved-Caspase-3蛋白統(tǒng)計(jì)結(jié)果；H.Caspase-3蛋白統(tǒng)計(jì)結(jié)果；a，與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b，與CME組比較，P＜0.05

抑癌基因PTEN于1997年首次被報(bào)道之后即成為研究熱點(diǎn)。PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，也是繼p53基因后另一個(gè)較為廣泛地與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切的基因。PTEN蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、黏附、遷移、浸潤(rùn)等方面具有重要作用［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN能夠被多種刺激因子激活，從而針對(duì)各類細(xì)胞發(fā)揮促凋亡作用［10］。目前越來(lái)越多的證據(jù)顯示PTEN是多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵調(diào)控因子，PTEN廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和纖維細(xì)胞，通過(guò)調(diào)控下游通路磷脂酰肌醇3-激酶/Akt參與調(diào)控細(xì)胞的肥大、心肌收縮力、細(xì)胞的成活及凋亡和細(xì)胞代謝［17］。在心肌缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)，PTEN高表達(dá)于心肌組織，與心肌細(xì)胞的凋亡發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)，抑制PTEN的表達(dá)，能夠減少心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，改善心功能［18］。也有研究肝缺血再灌注損傷，亦發(fā)現(xiàn)PTEN參與肝細(xì)胞凋亡，加重肝功能的惡化，抑制PTEN的表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象［19］。既往本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在豬CME模型中抑制PTEN/Akt通路，可降低促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能［5］。

阿托伐他汀除了具有降低膽固醇作用外，還具有多種心血管益處，包括抗炎和抗細(xì)胞凋亡。近年來(lái)，許多研究進(jìn)一步驗(yàn)證了其在心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型［11］、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化［12］、心肌梗死［13］和腎缺血再灌注損傷［14］中的抗細(xì)胞凋亡作用。越來(lái)越多的研究表明，阿托伐他汀可能調(diào)節(jié)PTEN/Akt細(xì)胞信號(hào)通路，盡管他汀類藥物在不同的病理?xiàng)l件下可能具有不同的調(diào)節(jié)作用。Miraglia等［20］證明他汀類藥物可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)，抑制磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路的激活，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，Wu等［21］發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以抑制心臟黏液瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，主要是通過(guò)促進(jìn)黏液瘤細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)。實(shí)際上，PTEN/Akt信號(hào)通路在缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要的內(nèi)源性心臟保護(hù)作用［22-23］，阿托伐他汀可抑制PTEN蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)Akt信號(hào)通路的激活［24］。鑒于上述發(fā)現(xiàn)，本研究提出在CME動(dòng)物中預(yù)處理阿托伐他汀可通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN/Akt通路減弱心肌細(xì)胞凋亡來(lái)預(yù)防CME相關(guān)的心肌功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀預(yù)處理可以通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡來(lái)減少CME誘導(dǎo)的心肌損傷。此外，本研究表明PTEN/Akt通路的調(diào)節(jié)似乎是阿托伐他汀的心臟保護(hù)作用的重要機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，CME發(fā)生后12 h，心肌組織PTNE蛋白表達(dá)明顯升高，凋亡蛋白Caspase-3活化明顯增高，心肌細(xì)胞調(diào)亡顯著增加，心臟功能明顯下降；然而，通過(guò)阿托伐他汀預(yù)處理，能夠明顯抑制PTNE蛋白表達(dá)及凋亡蛋白Caspase-3活化，激活p-Akt表達(dá)，降低心肌細(xì)胞凋亡，從而改善心臟功能。本研究為未來(lái)在PCI圍術(shù)期使用阿托伐他汀降低心肌損傷，改善心功能及長(zhǎng)期預(yù)后提供理論依據(jù)。